近年来肿瘤干细胞理论备受人们关注,越来越多的研究结果表明:肝癌发生与肝干细胞之间关系密切,肝癌中可能存在肝癌干细胞。肝干/祖细胞研究中发现的一些较为特异的标志物,也常常能在肝癌细胞系中检出。但由于以往对正常肝干细胞的解剖学定位及特异性标志仍不明确,目前尚无肝癌干细胞分离成功的报道。自Goodel等首次报道了利用Hoechst33342染色分选边缘群（side population, SP）可以从骨髓中富集造血干细胞以来,边缘群细胞分选相继在多种实体瘤的肿瘤干细胞分离中获得成功;本实验室近年来通过许多研究已证实利用边缘群分选可以从多种肝癌细胞系及原发性肝癌标本中富集到肝癌干细胞,而进一步的研究显示肝癌干细胞不仅是原发性肝癌的始动细胞,也可能直接参与了肝癌的侵袭与转移,但目前还未见有从肝癌远处转移灶中分离出具有干细胞特征肝癌细胞的报道。本实验研究拟探讨利用化学致癌剂二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠肝癌肺转移模型,采用边缘群分选方法从大鼠肺转移灶中分离干细胞样肝癌细胞,并对其干细胞特征、侵袭转移能力进行鉴定。方法1大鼠肝癌肺转移模型的建立将20只适龄雄性SD大鼠随机平均分成4组,随机抽取其中3组为实验组,剩余为对照组;实验组大鼠均给予0.1%DEN生理盐水灌胃,3次/周,共计四周;对照组大鼠予以正常喂养,所有大鼠均在20周后处死,解剖胸腹腔,观察肝脏及肺部病变。2肺转移肝癌细胞的原代培养切取肺部转移灶,减碎成1mm3大小的组织块,0.25%Ⅳ型胶原酶37℃下消化组织块10分钟,Hank’s缓冲液洗涤组织块3次,将组织块接种至培养瓶,加入含10%胎牛血清的Wiliam’s E培养基,置于37℃、5%CO₂孵箱内培养,常规换液。3肺转移性肝癌组织边缘群细胞分选0.25%胰酶-EDTA液将肝癌肺转移灶细胞消化成单细胞悬液,参照Goodel等的文献报道,进行Hoechst33342染色,染色结束后向细胞悬液中分别加入PE标记的c-kit和Sca-1抗体,在流式细胞仪中进行检测及分析。4肺转移肝癌SP细胞表达干细胞标志物的检测在流式细胞仪上分析边缘群细胞的同时,在PE通道分别检测边缘群及非边缘群细胞c-kit、Sca-1的表达百分比。5 SP及非SP表型的肺转移肝癌细胞在无血清培养基中的体外培养将分选得到的细胞分别接种至两个预先包被好Matrigel的两个培养皿中,并添加含HGF的无血清DMEM F12培养基,放至37℃、5%CO₂孵箱中培养,每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况,每隔两天更换无血清DMEM F12培养基一次。6软琼脂克隆形成实验在细胞培养板中制备0.6%底层琼脂培养基,将分选得到的边缘群和非边缘群肺转移肝癌细胞悬液计数,并调整细胞密度至1×10⁴/ml,分别取两组各40μl细胞悬液,在37℃与1m10.3%顶层琼脂培养基混匀后,立即浇入培养板中已凝固的底层琼脂上,振匀,确保顶层培养基覆盖整个底层培养基,置室温下定型凝固;将培养皿放入37℃、5%CO₂孵箱中培养,每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况,计数克隆数目;重复5次,计算平均克隆数目,Student t检验比较SP细胞和non-SP细胞平均克隆数目。7自我增殖实验将分选得到的SP细胞和non-SP细胞分别在无血清培养基中培养2周后,再次予以Hoechst33342染色后,分析两组细胞中边缘群细胞的含量。8 Transwell侵袭实验在细胞培养板中制备Martrigel胶,将肺转移肝癌SP细胞、non-SP细胞、未分选肺转移肝癌细胞分别加入含培养液及趋化因子的该培养板中,37℃条件下培养12小后,镜下观察计算平均穿膜细胞数。细胞侵袭试验中获得的穿膜细胞数数据用x±s表示,应用SPSS10.0软件进行ANOVA分析。9体内成瘤实验将分选得到的SP肝癌肺转移细胞和non-SP肝癌肺转移细胞用无菌技术接种至裸鼠右侧背部皮下,每组各10只裸鼠,每只裸鼠的接种细胞总数经流式细胞仪计数分选均为2×104个,每隔3天观察皮下肿瘤的生长情况,一周后处死裸鼠,称量皮下肿瘤重量及体积。结果1大鼠肝癌晚期出现肺转移对照组大鼠生长情况良好,病理解剖各组织器官未见异常;实验组大鼠处死后解剖发现:肝脏均出现不同程度的肝硬化,肝脏表面满布癌结节,其中2只大鼠双肺表面可见粟粒样转移性癌结节,部分肺组织经固定包埋切片后,行H.E染色镜检证实为肝癌肺转移灶。2肺转移灶肝癌细胞体外培养的镜下观察组织块接种至培养瓶24小时后,可见组织块边缘有大量细胞释放;在后续培养中陆续可见到大量细胞从组织块中释放、贴壁、伸展成上皮样细胞,培养7天去除组织块后,在原植块位置可见到明显的上皮样细胞岛形成。3肺转移性肝癌SP细胞的分离细胞经Hoechst33342染色后在流式细胞仪上检测的结果:以Hoechst red为X轴、Hoechst blue为Y轴所作的二维散点图中,在远离肝癌细胞集中区域的左下角部分,可见到一小部分光点聚集,它们表现为低Hoechst blue和低Hoechst red的特征,与其它绝大多数肝癌细胞的散射荧光特征明显不同,该群位于边缘的“特殊”细胞即“边缘群细胞”（SP细胞）。4肺转移性肝癌SP细胞高表达干细胞标志物SP细胞表面c-kit表达率为85%,Sca-1表达率为75%,而non-SP细胞表面c-kit及Sca-1表达率分别仅为8%和3%。5具有SP和non-SP表型的肺转移肝癌细胞在体外无血清培养基中的培养SP表型的肺转移肝癌细胞在无血清培养基中仍保持有增殖的能力,而non-SP细胞组未观察到明显的增殖现象;培养10天后,倒置显微镜下观察发现SP表型的肝癌细胞在无血清培养基中形成了多个岛屿样的细胞克隆;而non-SP肝癌细胞组此时仍未见有显著的增殖,倒置显微镜下观察发现有未贴壁的死亡细胞。6肺转移肝癌SP细胞软琼脂克隆形成能力高于non-SP细胞SP肺转移肝癌细胞在软琼脂培养基中培养3周后,大部分细胞形成了明显的细胞克隆,细胞克隆呈桑椹样,每个克隆由16-20个细胞组成,细胞呈透亮的球形,平均克隆形成率达到了69.90%;而non-SP表型的肺转移肝癌细胞在软琼脂培养基中未能形成明显的细胞克隆,大部分细胞趋于凋亡、崩解,该组细胞的平均克隆形成率仅为15.25%。t=20.46,n=5,P<0.01。7自我增殖实验将上述SP细胞和non-SP细胞用Hoechst33342染色并经流式细胞仪检测后,SP细胞组仍能检测到特征性的SP细胞群,而非SP肝癌细胞组在体外无血清条件下培养后,不仅无法再检测到特征性的SP细胞群,且在流式细胞检测中出现了明显的死亡细胞群。8 Transwell侵袭实验肺转移肝癌SP细胞侵袭穿膜细胞数目均明显高于non-SP细胞及未分选细胞,显示肝癌肺转移SP细胞体外侵袭能力强于non-SP细胞及未分选细胞。F=9.519481,P=0.002142。9裸鼠体内成瘤实验肿瘤细胞种植一个月后,SP细胞种植组裸鼠成瘤率,瘤体重量及体积明显高于non-SP细胞种植组。SP细胞体内成瘤能力明显高于non-SP细胞。结论来源于肝癌肺转移肿瘤组织的SP肝癌细胞群中富含具有干细胞特征的“特殊”细胞,这些“特殊”的细胞既具有形成和重建肝癌组织的能力,也具有较强侵袭转移能力,还通过自我增殖保持自我更新,它们在肝癌肺转移组织中发挥了类似正常组织中干细胞的角色和作用。肝癌肺转移组织可能具有较强的异质性,其中包含肝癌干细胞和非干细胞,利用Hoechst33342染色结合流式细胞术分选的方法可得到具备肝癌干细胞特征的SP细胞,SP细胞相对于肝癌肺转移组织中的non-SP细胞具备较强的自我增殖能力、侵袭转移能力以及成瘤能力,肝癌SP细胞可能直接参与了肝癌的转移及复发。