体细胞核移植,细胞融合,重编程技术或者培养体系的改变能够改变细胞的命运,甚至重塑其功能,如成体细胞可重编程回到多能干细胞的状态。灵长类多能干细胞根据其发育能力、细胞形态、基因表达谱以及表观遗传学的差异分为初始态多能干细胞(Primed Pluripotent Stem Cells,pPSCs)和原始态多能干细胞(Naive Pluripotent Stem Cells,nPSCs)。nPSCs因其容易进行基因工程处理以及体内外再生出功能的组织器官等优势,而在临床潜在应用上备受关注,因而有效的将胚胎干细胞维持在它们的原始状态对干细胞的基础及临床研究具有重要意义。研究表明,nPSCs的线粒体活性和自我更新能力要高于pPSCs,且这两种多能性干细胞在DNA甲基化等方面都存在明显差别。基于我们实验室的前期研究,我们在世界上首次通过改变培养体系能够将食蟹猴的Primed ESCs(胚胎干细胞)转化为能产生嵌合体猴的Naive-likePSCs。通过对两种细胞系的基因表达谱分析,虽然两者多能性基因差异并不明显,但是Naive多能干细胞中甲基化酶DNMT3A和DNMT3B基因表达水平却很低,这也揭示了这两种状态的干细胞的DNA甲基化程度可能存在差异。但DNA甲基化是否在nPSCs的转化及高水平的代谢过程中起到重要的作用,目前仍不清楚。本论文通过利用CRSPR/Cas9技术,首先选择食蟹猴初始态多能干细胞(pPSCs)和Naive-like PSCs)之间差异显著的两个甲基化转移酶基因DNMT3A和DNMT3B进行基因敲除,我们获得了稳定的DNMT3A-/+DNMT3B-/-的稳定细胞系;通过Naive-like PSCs转化效率的研究,我们发现DNMT3A和DNMT3B的敲除显著地(P≤0.05)增加了 Naive-like PSCs的转化,证明DNA的低甲基化水平,有利于Naive-likePSCs的转化。进一步研究证明DNMT3A和DNMT3B的敲除能显著促进Naive-like PSCs的代谢更新能力,显示在Naive-like PSCs中甲基化与代谢的相关性。我们的研究为理解灵长类干细胞的多能性提供了新的思路。大脑是人体最为复杂的器官之一,不仅含有多种类型的细胞,而且其发育机制也是最复杂且至今尚不清楚的重要科学问题。最近的研究表明很多神经性疾病,如绝大多数的神经管发育缺陷、小儿癫痫、小脑症、自闭症、Rett综合症、智力发育迟滞等疾病,主要是胎儿期脑细胞的发育或功能上出现异常所导致。虽然目前人们对这些疾病的研究有了一定的了解,但对脑发育的研究较为缺乏,这也导致了我们对这些神经性疾病的发病机理并不十分清楚。神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)是指存在于中枢神经系统中,能够自我更新并分化为神经元(Neuron)、星形胶质细胞(Astrocytes)和少突胶质细胞(Ogliodendrocyte)三种谱系的多潜能细胞。神经干细胞不仅是大脑发育、神经再生及脑进化研究的细胞基础,也是药物筛选及神经退行性疾病治疗的研究途径,因此,对神经干细胞发育以及分化的研究进而成为药物治疗神经性疾病及脑发育研究的基础。神经干细胞在脑部发育过程中主要经过两个不同的发育阶段,即神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cells,NESCs)和放射胶质前体细胞(radial glial progenitor cells,RGPCs)。NESCs是指从神经板到神经管阶段的神经干细胞,是最早的神经干细胞,具有很强的增殖和分化能力,能产生整个脑部的神经细胞和高纯度(>80%)的神经元。NESCs在体内只是短暂的存在,它的异常增殖和分化将导致神经管和脑部的发育缺陷。当神经管闭合后,NESCs快速的转化为RGPCs,而转化后的RGPCs将进一步增殖分化产生不同脑区的神经元,进而实现脑的正常发育。因此,NESCs往RGPCs的转化(NESCs-RGPCs)是脑发育中的一个重要的事件,研究其发育学机制对于理解脑发育以及脑发育缺陷性疾病具有重要的科学价值。然而,由于这个转化是一个快速的过程,而且以往建立的神经干细胞体系无法稳定地长期培养NESCs和精确实现“NESCs-RGPCs”的转化,因此很难对这个过程进行精确的体内外研究。最近,我们实验室开发了一个全新的、简单的、成分限定的、强大的(robust)培养体系。这套培养体系包括如下:将人和猴胚胎干细胞以及诱导多能干细胞(iPS)定向诱导分化为高纯度的神经上皮干细胞以及长期稳定的NESCs培养体系。在这套体系下,我们发现NESCs可以实现“NESCs-RGPCs”的转化。这些前期研究为我们研究"NESCs-RGPCs”的转化提供了独特的细胞模型。在本研究中,我们发现撤掉Wnt信号激活剂CHIR99021后,NESCs能快速地转化为RGPCs,表明Wnt信号通路对于维持其NESCs的自我更新以及对“NESCs-RGPCs”转化起着关键性的作用。RNA测序分析早、中期、晚期NESCs,转化后第7天的RGPCs和NESCs-ND(分化神经元)之间的相互关系,我们证实神经管形成和神经上皮干细胞的干性维持需要依赖较高的线粒体能量代谢和Wnt信号通路。神经上皮干细胞对端脑发育起决定性作用,且神经上皮干细胞转变为放射状胶质祖细胞(RGPCs)是通过Wnt信号通路精确调节了这种转变。代谢组学的研究也显示相比较于RGPCs,NESCs表现出高度的代谢差异。同时,我们使用化学药物,单羧酸转运蛋白(MCT1)抑制剂AZD3965,阻止进入和离开细胞的乳酸盐转运活动,抑制糖酵解来抑制神经干细胞的能量代谢,并从代谢产物和信号通路等方面分析能量代谢被抑制后的神经干细胞的变化。本课题的研究,一方面为RGPCs的神经转化提供了理想的细胞模型,另外一方面促进我们对代谢在神经细胞发育中作用的理解。