目的: 1、建立正常新生大鼠高氧性脑损伤模型，结合神经发育行为学方法研究高氧对新生大鼠神经系统发育和远期结构、功能的影响； 2、动态观察不同吸氧时间，新生大鼠脑内小胶质细胞的活化、TNF-αmRNA和蛋白、JNK磷酸化、NF-κB表达水平和脑细胞凋亡程度，结合高氧对脑组织氧化/抗氧化指标的影响，探讨高氧对未成熟脑发育和脑损伤的影响及其机制； 3、以抗氧化剂NAC作为干预药物，观察NAC对常压高氧性脑损伤的干预作用及探讨可能的作用机制。 本论文结构: 本课题主要分三部分进行研究和论述： 1、新生大鼠常压高氧性脑损伤模型的建立。 2、氧化应激损伤、促炎性细胞因子TNF-a、活化的小胶质细胞、转录因子NF-κB、JNK在高氧性脑损伤中的作用。 3、N-乙酰半胱氨酸对常压高氧性脑损伤的干预作用。 第一章新生大鼠常压高氧性脑损伤模型的建立 一、材料和方法:1、实验动物和模型制备250-300g左右SD大鼠，雌雄交配(4:1)，孕21-23d自然分娩的新生鼠中，取体重12～18g的7日龄新生鼠(雌雄不限)，随机分为高氧模型组和空气对照组。高氧组置于氧箱(有机玻璃箱)中，调节氧流量(3L/min)使箱内氧浓度维持在(80.0±2.0)％，每日用数字式测氧仪进行监测，箱内放置钠石灰吸收大鼠呼出的CO2，使其浓度低于0.5％。每天开箱1h，喂水及饲料，更换垫料，与空气组互换母鼠以避免母鼠因氧中毒而影响哺乳。空气组置于同一室内空气中，氧浓度21.0％，饲养条件与高氧组相同。部分动物21日龄时断奶，雌雄分笼并标准饲料喂养至37日龄，进行Morris水迷宫测试。 2、样本获取和指标观察(1)以上两组分别于生后8天(高氧/空气暴露24小时)、10天(高氧/空气暴露72小时)记录新生大鼠死亡数目，并计算死亡率。观察新生大鼠在高氧暴露后的一般状态，记录体重、脑重增长情况。 (2)空气/高氧开始暴露30min后，各处死3只大鼠，行动脉血气分析。 (3)空气/高氧开始暴露72h后，各处死10只大鼠，测量脑组织含水量。 (4)依高氧暴露时间分2h、6h、12h、24h、72h组，在高氧组各时间点，新生鼠分别于开始吸氧后24小时、72小时被处死，每组10只大鼠。空气组新生鼠处死日龄与高氧组相同；空气/高氧暴露72h组在生后15d、42d，完成神经行为功能测试后，各处死10只大鼠。观察新生鼠大脑病变：①HE染色观察脑组织形态学改变及计算42日龄左脑海马CA1区存活神经元数目。②免疫组织化学染色观察空气/高氧暴露72h组生后10d、15d、42d脑组织MBP表达。③TUNEL(原位细胞凋亡检测法)观察高氧暴露2h、6h、12h、24h、72h、15d脑组织细胞凋亡指数。 (5)空气/高氧暴露72h组生后8-15d、37-41d进行神经行为功能检测。 3、统计分析 所有实验数据用Exce12003及SPSS10.0统计学软件进行处理。实验结果以均数±标准差“-x±s”表示。早期神经行为异常发生率的比较用卡方检验，水迷宫实验组间穿环次数比较用秩和检验((kruskal-Wallis)，其余数据多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两之间进一步比较用SNK-q检验，α=0.05为显著性检验标准。 二、结果: 1、高氧对新生大鼠死亡率和一般状态的影响两组新生大鼠在空气/高氧暴露吸氧24h、72h的死亡率均小于5％，两组间差异无显著性。在吸氧过程中、吸氧后均未出现惊厥、瘫痪等异常行为。空气组活泼好动、反应灵敏；高氧模型组部分动物出现精神不振、呼吸促、懒动、肌张力低等现象，但在第2～3天后逐渐恢复正常。 2、高氧对新生大鼠动脉血氧分压的影响空气组平均PaO2为87±2.71mmHg，而高氧组为219±10.7mmHg，高氧组明显高于空气组(P<0.01)。 3、高氧对新生大鼠体重增长的影响两组新生大鼠体重增长差异无统计学意义(P>0.05)。 4、高氧对新生大鼠脑重增长的影响高氧模型组各时间点新生大鼠脑重较空气组相对轻，但差异尚无统计学意义(P>0.05)。 5、高氧对新生大鼠脑含水量的影响高氧72小时组新生大鼠脑含水量为87.61±0.429％，空气组为86.54±0.832％，两组脑含水量有显著性差异(P<0.05)。 6、脑组织形态学改变与评价 三、小结: 1、常压高浓度氧可以引起新生大鼠脑水肿和脑细胞的凋亡； 2、高氧可抑制脑组织MBP的表达，影响脑组织髓鞘化过程； 3、高浓度氧可影响新生大鼠神经行为发育，引起远期学习、记忆功能的缺失。 第二章氧化应激损伤、促炎性细胞因子TNF-a、活化的小胶质细胞在高氧性脑损伤中的作用 一、材料和方法:1、实验动物和模型制备同第一章2、样本获取和指标观察(1)GSH、GSSG、GSH/GSSG、SOD、MDA检测：取7日龄新生大鼠16只分别于高氧/空气暴露)12h后即刻准确称取大脑皮质组织100mg，按说明书进行检测。 (2)依高氧暴露时间分2h、6h、12h、24h，在高氧组各时间点，新生鼠分别于开始吸氧后24小时、72小时被处死，每组10只大鼠，空气组动物处死日龄与高氧组相同；空气/高氧暴露72h组生后15d各处死10只大鼠。脑组织4％多聚甲醛灌注固定后，进行免疫组织化学染色观察脑组织TNF-a、Caspase-3的表达水平，免疫荧光染色脑组织活化小胶质细胞标记物ox-42的表达水平。 (3)高氧暴露后2h、6h、12h、24h各处死4只大鼠，取左脑组织提取RNA，RT-PCR检测TNF-amRNA，以β-actin为内参，计算相对单位，并与空气对照组比较；取右脑组织分别提取总蛋白和胞核蛋白，WesternBlot检测脑组织JNK的表达及其磷酸化情况和NF-κB表达水平，以GAPDH蛋白为内参照，并与空气对照组进行比较。 3、统计分析: 实验结果以均数士标准差“-x±s”表示，各组均数采用单因素方差分析(ANOVA)，两两之间进一步比较用SNK-q检验，α=0.05为显著性检验标准。 二、结果: 1、高氧对脑组织氧化应激指标的影响高氧可引起脑组织GSH、SOD水平下降，GSSG、GSSG/GSH、MDA水平升高 2、高氧对脑组织ox-42、TNF-a、caspase-3表达水平的影响随着吸氧时间的延长，脑组织ox-42、TNF-a、Caspase-3的表达水平明显升高，以12-24h达高峰，吸氧后8天降至空气对照组水平(P>0.05)。 3、高氧对TNF-amRNA表达的影响随着吸氧时间的延长，脑组织TNF-amRNA表达水平明显升高，以12-24h达高峰，吸氧后8天降至空气对照组水平(P>0.05)。 4、高氧对脑组织JNK、JNK磷酸化、NF-κB的影响随着吸氧时间的延长，脑组织JNK磷酸化、NF-κB表达水平明显升高，以12-24h达高峰；JNK的表达各时间点无明显变化(P>0.05)，与空气对照组比较无显著性差异(P>0.05)。 三、小结: 1、高氧组动物脑组织GSH、SOD的水平下降，GSSG、GSSG/GSH、MDA水平较空气对照组高，说明高氧引起脑组织的氧化应激及氧化损伤。 2、高氧可以增加脑组织caspase-3、ox-42、TNF-amRNA及蛋白的表达；他们的表达水平与高氧暴露时间有关，说明小胶质细胞的活化、TNF-a介导的炎症反应参与了高氧性脑损伤的过程。 3、高氧同时激活脑组织JNK、NF-κB的活化，两者的活化水平也与高氧暴露时间相关。JNK、NF-κB通路活化可能介导小胶质细胞的活化、TNF-a过表达。 第三章N-乙酰半胱氨酸对常压高氧性脑损伤的干预作用 一、材料和方法:1、实验动物和模型制备实验动物同前。高氧模型制备同第一章。吸氧时间因检测指标不同而异。 2、样本获取和指标观察2.1脑组织含水量变化空气/高氧开始暴露后12h各处死10只大鼠，测量脑组织含水量。 3、统计方法同第一章 结论: 1、常压高浓度氧可以引起新生大鼠脑细胞的凋亡，影响脑组织髓鞘化过程及神经行为发育，导致远期学习、记忆功能的缺失。 2、高氧模型组动物脑组织GSH、SOD的水平较空气对照组下降，GSSG、MDA水平较空气对照组高。说明高氧引起脑组织的氧化应激及氧化损伤，介导了高氧引起的脑细胞凋亡。 3、高氧可以诱导caspase-3、ox-42、TNF-amRNA及蛋白的表达，表达水平与高氧暴露时间有关，说明小胶质细胞的活化、TNF-a介导的炎症反应可能通过激活死亡信号通路参与了高氧性脑细胞的凋亡过程。 4、高氧同时激活脑组织JNK、NF-κB的活化，两者的活化水平也与高氧暴露时间相关。JNK、NF-κB通路活化可能介导小胶质细胞的活()TNF-a过度表达。 5、NAC可通过抑制高氧引起的氧化应激及JNK、NF-κB的活化，拮抗小胶质细胞的活化、TNF-a介导的炎症反应，减轻了高氧引起的急性期脑损伤，但尚未能改善其远期预后。