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目的:探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1Al(uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A1,UGT1A1)基因野生型和Q239X突变型在非洲绿猴肾细胞(cos-7细胞)中的表达及功能。方法:构建UGT1A1基因野生型过表达、UGT1A1基因Q239X突变型过表达慢病毒载体和阴性慢病毒载体,分别对体外培养的cos-7细胞进行转染。转染72h后,荧光倒置相差显微镜及流式细胞仪观察和检测cos-7细胞的转染效率,用l.Omg/L嘌呤霉素筛选1周得到稳定转染细胞株,采用DNA测序鉴定所构建的稳定转染UGT1A1基因的cos-7细胞株。将cos-7细胞分为5组:空白对照组,阴性慢病毒组,UGT1A1基因野生型组,UGT1A1基因Q239X杂合突变型组,UGT1A1基因Q239X纯合突变型组。PCR、Real-Time PCR和 Western Blot检测各组cos-7细胞中UGT1A1 基因的DNA、mRNA和蛋白表达情况;绘制非结合胆红素的标准曲线,设计两组反应,野生型为对照组,Q239X杂合突变型为实验组,催化非结合胆红素与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)的结合反应,利用高效液相色谱仪(High performance 1 iquid chromatograph,HPLC)定量检测非结合胆红素浓度变化,分析两组UGT1A1酶对非结合胆红素的催化活性。结果:1.荧光倒置相差显微镜观察阴性病毒组、UGT1A1基因野生型组、UGT1A1基因Q239X杂合突变组、UGT1A1基因Q239X纯合突变组的cos-7细胞均可见明显的绿色荧光表达并且细胞状态良好,流式细胞仪检测转染效率均>85%,转染效率高,可用于后续实验。2.DNA测序结果显示稳定过表达UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型cos-7细胞株构建成功。3.结合突变位点设计引物并进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,结果显示UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型cos-7细胞在DNA水平均可见UGT1A1基因表达,而空白对照组、阴性慢病毒组无UGT1A1基因表达。4.Real-Time PCR结果显示UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型cos-7细胞UGT1A1基因的mRNA表达量较空白对照组和阴性慢病毒组均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。但UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型、Q239X纯合突变型细胞UGT1A1基因的mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。5.Western blot结果显示UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型cos-7细胞在55kD处可见UGT1A1蛋白表达,蛋白表达量有差异(P<0.05),而空白对照组、阴性慢病毒组、Q239X纯合突变型组无UGT1A1蛋白表达。6.绘制非结合胆红素的标准曲线,得到方程式:y=68028x+6813.7,R2=0.9923(其中x为非结合胆红素浓度μM,y为非结合胆红素峰面积),非结合胆红素在0.25-2μM浓度范围内与非结合胆红素峰面积线性关系良好。7.分别用UGT1A1基因野生型、Q239X杂合突变型cos-7细胞模型匀浆催化非结合胆红素与UDPGA的葡萄糖醛酸化反应,UGT1A1野生酶和Q239X杂合突变酶在15min内的催化作用最强,使得结合胆红素的生成量最大,非结合胆红素浓度下降幅度最大,且Q239X杂合突变酶催化非结合胆红素浓度下降幅度低于UGT1A1野生酶。结论:1.UGT1A1基因Q239X突变不影响基因的转录表达。2.UGT1A1基因Q239X纯合突变使其翻译合成的谷氨酰胺变为终止密码子,基因表达终止,无UGT1A1蛋白生成。3.UGT1A1基因Q239X杂合突变可表达UGT1A1蛋白,其生成的UGT1A1酶催化非结合胆红素能力低于UGT1A1基因野生型。