第一部分Fractalkine在肾移植受者尿液和血液的表达对移植肾状态的无创性监测引言肾移植目前已经成为终末期肾病患者主要的治疗手段之一，随着近年来移植免疫研究的不断深入和新型免疫抑制剂的不断问世，急性排异发生率显著下降，一年移植物的存活率得到了明显的提高，但是由于急性排异不仅可以引起移植物早期失功，而且对后期慢性移植物肾病和移植物长期存活有直接的影响，急性排异仍然是术后主要并发症之一。在新型免疫抑制方案下，急性排异临床表现发生了很大的变化，移植肾区疼痛、少尿、血尿、发热、血压升高等传统表现多不典型，移植物的病理活检已经成为急性排异诊断的主要方法，但病理活检的有创性不可避免存在诸如出血、移植肾破裂等严重的并发症，较难被患者接受，同时活检无法在短期内反复进行，不利于动态随访观察，特别是在门诊患者中；另外活检标本还存在代表性问题，穿刺局部的组织有时候并不能很好的代表整个移植物的状态；而且病理结果与移植物状态可能并不完全一致，有时候移植物功能已经改善，但病理改变仍然很严重，反过来有时候临床上移植物功能严重受损但病理改变却很轻微，不利于指导治疗。由于无创性检查已经成为疾病诊断的发展方向，同时目前的病理活检还无法满足临床需要，寻求无创性检查来辅助移植物功能监测，为急性排异和亚临床排异的诊断提供帮助，预测抗排异治疗的反应，估计移植物失功的风险，对病理活检进行有益的补充，这已经成为移植界新兴的课题。正是基于上述原因，我们对Fractalkine在肾移植受者尿液和血液中的表达进行了研究，迄今尚无类似报道。材料和方法1．病例选择2001年6月—2005年12月，在本中心接受肾脏移植患者中，术后6月内血肌酐较基础值升高25％以上且移植肾活检病理诊断为急性排异67例，移植肾功能稳定且术后1—2月程序活检病理诊断为移植肾状态(未见组织学损害，No-AR)119例，移植肾功能稳定且术后1—2月程序活检病理诊断为亚临床排异13例，病理证实的急性肾小管坏死11例以及慢性移植肾肾病14例。另外在我院体检中心健康体检的80例体检者作为健康对照2．尿液和血液标本留取留取移植肾状态者术后2、4、6、8周晨尿尿标本476份和程序活检时尿标本119份与血标本85份；急性排异者、亚临床排异者活检时尿标本67、13份和血标本64份、13份；急性肾小管坏死者、慢性移植物肾病者活检时尿标本11、14份；34例急性排异者排异前尿标本34份；45例急性排异逆转后尿标本45份；亚临床排异者活检前尿标本13份；另外留取健康对照者晨尿尿标本和血标本各80份。3．用ELISA的方法测定上述尿液和血液标本Fractalkine的水平，比较术后不同时间Fractalkine水平的差异；比较各组间Fractalkine水平的差异，分析Fractalkine水平对急性排异、亚临床排异、细胞性排异和体液性排异、激素敏感性排异和耐激素排异以及移植物失功的诊断和预测价值，比较排异前后Fractalkine水平，为动态监测提供依据。4．免疫组化的方法研究急性排异者、移植肾状态者和供肾组织Fractalkine的表达的差异。5．统计学方法：ELISA的实验数据采用均数±标准误，尿标本的数据均用尿肌酐值校正。不同组间比较采用Mann—Whitney U Test，Kruskal—Wallis Test，Wilcoxon Signed Ranks Test。构建Conventional Receiver Operating Characteristic(ROC)curve评价尿液和血液的Fractalkine水平诊断急性排异、亚临床排异的特异性和敏感性，预测激素敏感性排异、耐激素排异以及移植物失功的特异性和敏感性，同时计算ROC曲线下面积，约登(Youden)指数来得到最适特异性和敏感性的Fractalkine水平。以P＜0.05为差异有显著性。结果一、Fractalkine尿中的表达对移植肾状态无创性监测1．119例移植肾功能稳定的受者(No—AR)术后2、4、6、8周尿Fractalkine基本稳定，四个不同时段尿Fractalkine的水平无明显差异(P=0.773)。2．67例急性排异受者尿Fractalkine水平(407.52±57.02，95％CI：293.68-521.35ng／mmol creatinine)明显高于移植肾功能稳定者(64.83±9.40，95％CI：46.22-83.44ng／mmol creatinine)和健康对照(30.53±4.78，95％CI：21.02-40.04 ng／mmolcreatinine)，P＜0.001。急性排异受者尿Fractalkine水平也明显高于急性肾小管坏死(103.55±36.24，95％CI：22.80-184.29 ng／mmol creatinine，P=0.004)和慢性移植物肾病者(96.02±32.91，95％CI：24.92-167.12 ng／mmol creatinine，P=0.001)。构建诊断急性排异的ROC曲线，曲线下面积0.834(95％CI：0.770—0.899，P＜0.001)，结合特异性和敏感性最适组合，当Fractalkine=102.88ng／mmol creatinine，诊断急性排异的敏感性和特异性分别达到82.1％和76.5％，P＜0.001。3．尿Fractalkine在细胞性排异和体液性排异中的表达分别为：395.43±72.00，95％CI：250.13-540.73 ng／mmol creatinine和429.17±95.14 ng／mmol creatinine，95％CI：232.37-625.98 ng／mmol creatinine，二者间没有统计学差异(P=0.824)。4．耐激素排异受者尿Fractalkine水平(568.48±86.29，95％CI：393.80-743.17ng／mmol creatinine)要明显高于激素敏感性排异者(183.31±34.93，95％CI：111.63-254.99 ng／mmol creatinine)，P＜0.001。移植物失功受者尿的Fractalkine水平(671.37±266.62，95％CI：116.85-1225.89 ng／mmol creatinine)似乎明显高于急性排异逆转的受者(376.73±57.43，95％CI：261.82-491.64 ng／mmol creatinine)，P=0.065。在急性排异受者中，根据尿的Fractalkine水平构建诊断耐激素急性排异的ROC曲线，曲线下面积0.771(95％CI：0.659—0.884，P＜0.001)，结合特异性和敏感性最适组合，当Fractalkine=233.76 ng／mmol creatinine，敏感性和特异性分别达到74.4％和75.0％，P＜0.001。5．急性排异前尿Fractalkine水平(85.82±25.38，95％CI：34.18—137.46ng／mmol creatinine)明显低于排异发生时(377.61±55.81，95％CI：264.06—491.16ng／mmol creatinine)，P＜0.001。急性排异逆转后尿Fractalkine水平(60.89±17.04，95％CI：26.56—95.23 ng／mmol creatinine)明显低于排异发生时(441.32±72.67，95％CI：294.86—587.79 ng／mmol creatinine)，P＜0.001。6．亚临床排异者尿Fractalkine水平(237.70±65.85，95％CI：94.21—381.18ng／mmol creatinine)明显高于移植肾状态者(P＜0.001)和2周前的水平(55.03±26.36 ng／mmol creatinine，P=0.006)，但与急性排异者没有达到统计学差异，P=0.248。在程序活检的受者中，根据尿的Fractalkine水平构建诊断亚临床排异的ROC曲线，曲线下面积0.836(95％CI：0.753—0.920，P＜0.001)，结合特异性和敏感性最适组合，当Fractalkine=79.48 ng／mmol creatinine，敏感性和特异性分别达到92.3％和70.6％，P＜0.001。二、Fractalkine血中的表达对移植肾状态无创性监测1．急性排异受者排异时血Fractalkine水平(2247.95±286.14，95％CI：1676.14—2819.76pg／ml)明显高于移植肾状态者(No—AR)(658.09±71.11，95％CI：516.68—799.50pg／ml)和健康对照者(286.74±77.09，95％CI：133.29—440.19 pg／ml)，P＜0.001。根据血的Fractalkine水平，构建诊断急性排异的ROC曲线，曲线下面积0.825(95％CI：0.765—0.886，P＜0.001)。结合特异性和敏感性最适组合，当Fractalkine=1108.75pg／ml，敏感性和特异性分别达到71.9％和80.0％，P＜0.001。急性细胞性排异者和体液性排异者血Fractalkine水平分别是2100.89±239.32、2528.71±703.82 pg／ml，二者无明显差异，P=0.838。耐激素排异者和激素敏感性排异者血Fractalkine水平分别是2730.61±468.64、1627.39±212.81 pg／ml，二者没有达到统计学差异，P=0.051。急性排异逆转的受者和移植物失功的受者血Fractalkine水平分别是1986.49±194.91、4376.97±2030.95 pg／ml，二者没有达到统计学差异，P=0.141。2．亚临床排异者血Fractalkine水平(1185.08±154.83，95％CI：1065.49—1591.46 pg／ml)明显高于移植肾状态者，P=0.002。根据血的Fractalkine水平构建诊断亚临床排异的ROC曲线，曲线下面积0.770(95％CI：0.667—0.873)，结合特异性和敏感性最适组合，当Fractalkine=805 pg／ml，敏感性和特异性分别达到76.9％和69.4％，P=0.002。亚临床排异受者血Fractalkine水平似乎低于急性排异者，P=0.05。三、Fractalkine在肾组织中的表达Fractalkine在急性排异肾组织中表达明显增强，可见多个小管的胞膜、管腔膜以及管周血管内皮细胞染成棕黄色，呈弥漫性分布，而在移植肾状态者肾组织中，偶见Fractalkine的表达；而在供肾组织中未发现Fractalkine的表达。结论作为无创性检查的手段，我们首次报告了尿液和血液的Fractalkine水平可能是监测移植肾状态的新方法，帮助诊断急性排异、耐激素排异和亚临床排异，为预测抗排异治疗反应和移植物失功的风险提供线索，急性排异前后Fractalkine水平的变化为动态观察和随访提供了新的指标。急性排异时，Fractalkine在肾小管上皮细胞和管周血管内皮细胞上的表达明显增强。第二部分血管内皮生长因子在肾移植受者尿液和血液的表达对移植肾状态的无创性监测引言无创性的诊断技术，是我们器官移植领域近年来发展的方向，通过第一部分的研究，我们初步揭示了测定尿液和血液Fractalkine的水平可能是无创性监测移植肾状态的新方法。移植排异是一个复杂的过程，许多因子和多个途径均参与其中，进一步探寻其它因子作为监测移植肾状态的“marker”，血管内皮生长因子(VEGF)是进入我们研究的另一个对象，VEGF除了增加血管的通透性、刺激血管内皮生长外，在免疫炎症过程中增强免疫炎症、趋化单核／巨噬细胞、增加黏附分子的表达等多个方面发挥作用，而通过VEGF在尿液和血液中的水平监测肾移植受者未见这方面的报道，我们就此开始研究。材料和方法1．病例选择2001年6月—2005年12月，在本中心接受肾脏移植患者中，术后6月内血肌酐较基础值升高25％以上且移植肾活检病理诊断为急性排异67例，移植肾功能稳定且术后1—2月程序活检病理诊断为移植肾状态(未见组织学损害，No-AR)119例，移植肾功能稳定且术后1—2月程序活检病理诊断为亚临床排异13例，病理证实的急性肾小管坏死11例以及慢性移植肾肾病14例。另外在我院体检中心健康体检的80例体检者作为健康对照2．尿液和血液标本留取留取移植肾状态者术后2、4、6、8周晨尿尿标本476份与程序活检时尿标本119份和血标本85份；急性排异者、亚临床排异者活检时尿标本67、13份和血标本64份、13份；急性肾小管坏死者、慢性移植物肾病者活检时尿标本11、14份；34例急性排异者排异前尿标本34份；45例急性排异逆转后尿标本45份；亚临床排异者活检前尿标本13份；另外留取健康对照者晨尿尿标本和血标本各80份。3．用ELISA的方法测定上述尿液和血液标本VEGF的水平，比较术后不同时间VEGF水平的差异；比较各组间VEGF水平的差异，分析VEGF水平对急性排异、亚临床排异、细胞性排异和体液性排异、激素敏感性排异和耐激素排异以及移植物失功的诊断和预测价值，比较排异前后VEGF水平，为动态监测提供依据。4．免疫组化的方法研究急性排异者、移植肾状态者和供肾组织VEGF的表达的差异。5．统计学方法：ELISA的实验数据采用均数±标准误，尿标本的数据均用尿肌酐值校正。不同组间比较采用Mann—Whitney U Test，Kruskal—Wallis Test，Wilcoxon Signed Ranks Test。构建Conventional Receiver Operating Characteristic(ROC)curve评价尿液和血液的VEGF水平诊断急性排异、亚临床排异的特异性和敏感性，预测激素敏感性排异、耐激素排异以及移植物失功的特异性和敏感性，同时计算ROC曲线下面积，约登(Youden)指数来得到最适特异性和敏感性的Fractalkine水平。以P＜0.05为差异有显著性。结果一、VEGF尿中的表达对移植肾状态无创性监测1．在移植肾功能稳定的受者(No—AR)中，术后早期尿中VEGF的水平基本稳定，四个不同时段(术后2周、4周、6周、8周)尿VEGF水平无明显差异(P=0.124)。2．急性排异受者排异时尿VEGF水平(28.57±6.21 ng／mmol creatinine，95％CI：16.18-40.97 ng／mmol creatinine)明显高于移植肾功能稳定者程序活检时(3.05±0.45ng／mmol creatinine，95％CI：2.17-3.93 ng／mmol creatinine)和健康对照(2.87±0.35ng／mmol creatinine，95％CI：2.16-3.57 ng／mmol creatinine)，P＜0.001。与急性肾小管坏死者没有达到统计学差异(11.05±3.27，95％CI：3.75-18.35 ng／mmol creatinine，P=0.266)，但要高于慢性移植物肾病者(5.96±2.64，95％CI：0.25-11.67 ng／mmolcreatinine，P=0.001)。根据尿的VEGF水平，构建诊断急性排异的ROC曲线，曲线下面积0.871(95％CI：0.820—0.921，P＜0.001)，结合特异性和敏感性最适组合，当VEGF=3.64 ng／mmol creatinine，敏感性和特异性分别达到85.1％和74.8％，P＜0.001。3．尿VEGF水平在急性细胞性排异和急性体液性排异者中分别为：28.75±8.69，95％CI：11.21-46.29ng／mmol creatinine和28.26±7.86 ng／mmol creatinine，95％CI：12.0-44.51 ng／mmol creatinine二者间没有统计学差异(P=0.20)。4．耐激素排异受者尿VEGF水平(42.09±10.00，95％CI：21.85-62.34 ng／mmolcreatinine)要明显高于激素敏感性排异者(9.74±2.63，95％CI：4.34-15.14 ng／mmolcreatinine)，P＜0.001。7例移植物失功受者尿的VEGF水平(106.66±38.60，95％CI：12.22-201.10 ng／mmol creatinine)明显高于60例急性排异逆转的受者(19.46±4.13，95％CI：11.21-27.72 ng／mmol creatinine)，P=0.001。在急性排异受者中，根据尿的VEGF水平分别构建诊断耐激素急性排异和急性排异后短期内移植物丢失的ROC曲线，曲线下面积分别为0.771(95％CI：0.658—0.884，P＜0.001)和0.881(95％CI：0.760—1.001，P=0.001)。结合特异性和敏感性最适组合，当VEGF=12.27 ng／mmol creatinine，诊断耐激素急性排异敏感性和特异性分别达到61.5％和85.7％，P＜0.001；当VEGF=22.48 ng／mmol creatinine，诊断急性排异后短期内移植物丢失敏感性和特异性分别达到85.7％和78.3％，P=0.001。5．急性排异受者排异前尿VEGF水平(2.69±0.78ng／mmol creatinine)明显低于排异发生时(13.42±2.96ng／mmol creatinine)，P＜0.001；急性排异逆转的受者中，排异逆转后尿VEGF水平(2.72±0.64ng／mmol creatinine)明显低于排异发生时(19.46±4.13ng／mmol creatinine)，P＜0.001。6．亚临床排异者尿VEGF水平(16.14±4.09，95％CI：7.21-25.06 ng／mmolcreatinine)明显高于无组织学损害的受者(3.05±0.45，95％CI：2.17-3.93 ng／mmolcreatinine)，P＜0.001，也明显高于健康对照者(P＜0.001)。在程序活检的受者中，根据尿的VEGF水平构建诊断亚临床排异的ROC曲线，曲线下面积0.819(95％CI：0.662—0.976，P＜0.001)；结合特异性和敏感性最适组合，当VEGF=9.90 ng／mmol creatinine，敏感性和特异性分别达到76.9％和90.8％，P＜0.001。二、VEGF血中的表达对移植肾状态无创性监测1．急性排异受者排异时血VEGF水平(126.76±9.76，95％CI：107.27—146.26pg／ml)明显高于移植功能稳定者(No—AR)(69.10±6.04，95％CI：57.09—81.11pg／ml)和健康对照者(55.38±7.87，95％CI：39.71—71.06 pg／ml)，P＜0.001根据血的VEGF水平，构建诊断急性排异的ROC曲线，曲线下面积0.744(95％CI：0.664—0.825，P＜0.001)。结合特异性和敏感性最适组合，当VEGF=91.71 pg／ml，敏感性和特异性分别达到62.5％和80.0％。急性细胞性排异者和体液性排异者血VEGF水平分别是118.62±12.12、142.30±16.29 pg／ml，二者统计学上无明显差异，P=0.143。耐激素排异者和激素敏感性排异者，血VEGF水平分别是102.92±11.95、145.31±14.01pg／ml，P=0.037，虽然耐激素排异更高一些，但构建ROC曲线后，曲线下面积仅0.653(95％CI：0.519-0.788)，最适特异性和敏感性组合时，当VEGF=167.44 pg／ml，敏感性和特异性仅38.9％和89.3％。急性排异逆转的受者和移植物失功的受者，血VEGF水平分别是113.90±9.19、209.20±27.58pg／ml，P=0.003，构建ROC曲线，曲线下面积0.843(95％CI：0.722-0.965)，最适特异性和敏感性组合时，当VEGF=198.68 pg／ml，敏感性和特异性分别是71.4％和87.3％。2．亚临床排异者血VEGF水平(126.96±20.13，95％CI：83.10—170.83 pg／ml)明显高于程序活检时无组织学损害的受者(69.10±6.04，95％CI：57.09—81.11pg／ml)，P=0.002，亚临床排异受者血VEGF水平与急性排异者无明显差异，P=0.765。在程序活检的受者中，根据血的VEGF水平构建诊断亚临床排异的ROC曲线，曲线下面积0.773(95％CI：0.641—0.904)，结合特异性和敏感性最适组合，当VEGF=105.31pg／ml，敏感性和特异性分别达到69.2％和84.7％，P=0.002。三、VEGF在肾组织中的表达在供肾组织和移植肾功能稳定的受者中，VEGF在部分小球的足突细胞散在的表达，个别肾小管也可见弱表达。但在急性排异时，VEGF在肾小球、小管、管周血管内皮细胞以及组织中浸润的单个核细胞上均可见明显的表达。结论通过无创性测定尿液和血液VEGF水平可能是对移植肾状态监测提供了新的方法，可以帮助急性排异和亚临床排异的诊断，为早期诊断和预测耐激素排异和急性排异后移植物失功的提供线索，VEGF水平在排异前后的变化可能成为随访和观察排异转归的指标。在急性排异时，VEGF在小球、小管、管周血管内皮细胞以及组织中浸润的单个核细胞上均可见明显的表达。第三部分供、受体血管内皮生长因子基因多态性对肾移植急性排异的影响引言肾移植受者长期使用免疫抑制剂无疑增加了感染、恶性肿瘤和心脑血管疾病的风险，但如果免疫抑制剂量不足急性排异和慢性排异的发生率也相应升高，免疫抑制药物如何在这二者间取得平衡是决定移植物长期生存的关键因素之一，个体化的方案显得尤为重要。在临床实践中，有些受者并不存在传统的影响排异的因素，却需要较大剂量的免疫抑制剂才能维持移植物功能甚至仍然反复发生排异反应，而另一些受者只需较小的剂量就可以获得移植物长期满意的存活，随着基因多态性研究的深入，这一临床现象可能与不同个体间的一些重要的免疫分子基因多态性有关。在第二部分研究中我们初步发现尿液、血液血管内皮生长因子可以提示急性排异的发生，推测VEGF可能参与急性排异的发生和发展，而已有证据表明VEGF的基因多态性不但对糖尿病肾病的发生产生影响，还可以明显的影响肾脏病的进展，基于此我们对肾移植受者和供体的VEGF的多态性进行研究，是否与急性排异的发生有关，受体和供体的基因型能否预测急性排异发生的危险性，试图为临床个体化的免疫抑制方案提供依据。材料和方法1．临床资料2001年6月—2006年6月在浙一医院肾脏病中心接受肾脏移植患者中，术后6月内血肌酐较基础值升高25％以上且移植肾活检病理诊断为急性排异79例，术后6月内移植肾功能稳定且术后1—2月程序活检病理诊断为移植肾状态(未见组织学损害，No-AR)145例。从本中心的移植标本库中选取上述受者淋巴细淋巴细胞标本和相应的供体脾细胞标本。另外收集183例在我院体检中心健康体检者的血标本。2．提取移植受者和健康对照者外周血DNA。3．提取供体脾细胞DNA。4．使用不同MGB探针和相应引物(TaqMan allelic discrimination assay)进行VEGF+405G／C和—460T／C两个单核苷酸多态性测定。5．比较移植受者和健康对照者、急性排异和移植肾功能稳定者这两个多态性位点基因型和等位基因分布。6．供体的VEGF+405基因型对急性排异的影响，不同供受体组合对发生急性排异的影响。7．统计学方法以x~2检验比较等位基因、基因型分布的差异，同时比较不同的供受体组合与急性排异的关系。基因多态性与急性排异风险之间的相关性以比值比(odds ratios，ORs)及其95％可信区间(confidence intervals，CIs)表示；P值＜0.05表示具有统计学意义。结果1．在肾移植受者中VEGF+405 CC型比例明显高于健康对照者，P＜0.001，CC型：GG型OR值2.459(95％CI：1.524—3.968)；在等位基因C与G的分布两组间也明显不同，P＜0.001，OR值1.868(95％CI：1.412—2.471)。VEGF—460的基因型在两组间的差异不明显，只在等位基因分布上，C等位基因在移植受者中的比例稍高一些，P=0.047，OR值1.371(95％CI：1.003-1.873)。2．在急性排异者中VEGF+405 CC型比例高于移植肾功能稳定者，P=0.02，CC型：GG型OR值1.89(95％CI：1.023—3.493)；在等位基因C与G的分布两组间也明显不同，P=0.004，OR值1.799(95％CI：1.202—2.691)。VEGF—460的基因型与等位基因在两组间的差异并不明显。3．供体VEGF+405基因型和等位基因在急性排异和移植肾功能稳定者间无明显差异。4．总体上VEGF+405供、受体基因型配对在6月内急性排异和移植肾功能稳定者两组间的分布无明显差异，P=0.147，但供、受体均为CC型者发生6月内急性排异的危险度是供、受体均为GG型的4.074倍(95％CI：1.146-14.481)，P=0.026。CC型受者接受GG型供肾与接受CC型供肾相比，似乎后者更容易发生急性排异，但没有达到统计学差异(OR值=2.256，95％CI：0.744—6.845，P=0.147)。结论VEGF基因多态性可以对急性排异的发生产生影响，+405CC型和C等位基因明显增加了急性排异发生的危险性，不同的供受体基因型组合与急性排异的发生相关，供受体均为CC型的急性排异危险性是均为GG型的4倍。另外VEGF+405CC基因型可能与慢性肾衰发生有关。