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实验目的本实验旨在研究通过激活和抑制经典Wnt信号通路对人牙周膜干细胞成骨分化的影响以及在此过程中Hippo信号通路的表达变化;探讨经典Wnt信号通路介导Hippo信号通路调控PDLSCs成骨分化的分子机制,揭示两种信号通路在干细胞成骨分化方面的交叉调控作用,为口腔组织再生工程中种子细胞优化提供理论依据。实验方法1.利用组织块贴壁法分离获得原代人牙周膜干细胞;使用流式细胞术检测干细胞表面标志物的表达水平;细胞经成骨和成脂诱导后检测其多向分化潜能;2.用人重组蛋白Wnta3a,DKK-1处理hPDLSCs,分别激活、阻断经典Wnt信号通路,q-PCR及Western blot检测经典Wnt信号通路中β-catenin、Wnt3a、LRP5、DVL、Axin及GSK3β的表达情况,ALP染色、茜素红染色及AKP半定量分析PDLSCs成骨能力改变;检测Hippo信号通路中TAZ、Mob、LATS1及磷酸化TAZ、Mob、LATS1的变化;荧光素酶报告系统检测经典Wnt信号通路转录区域TCF/LEF活性和Hippo信号通路转录区域TEAD活性;3.通过慢病毒转染,过表达TAZ(oeTAZ)和敲低TAZ(shTAZ),分别在Wnta3a,DKK-1 处理的基础上,设计 Wnta3a+shNC,Wnta3a+shTAZ,DKK-1+oeNC,DKK-1+oeTAZ的rescue实验验证TAZ是否为经典Wnt通路下游靶点,Co-IP验证β-catenin是否与LATS1形成蛋白复合体,通过设计筛选有效的LATS1干扰序列并包装慢病毒,进一步验证蛋白复合体的存在。实验结果1.成功分离出原代牙周膜干细胞并进行体外扩增培养;细胞表面阳性表达间充质干细胞特异性标志物,而阴性表达造血干细胞特异性标志物;经检测具有成骨、成脂的多向分化潜能。2.激活经典Wnt信号通路后,β-catenin、Wnt3a、LRP5和DVL表达增高,而Axin及GSK3 β表达降低,TCF转录家族活性增强,成骨相关因子Runx2、ALP和Col-1表达升高,促进PDLSCs成骨分化,Hippo信号通路中TAZ及磷酸化TAZ表达升高,而LATS1、Mob1及磷酸化LATS1、Mob1表达降低,TEAD家族转录活性增强;抑制经典Wnt信号通路后,β-catenin、Wnt3a、LRP5和DVL表达降低,而Axin及GSK3 β表达升高,TCF转录家族活性减弱;成骨相关因子Runx2、ALP和Col-1表达降低,抑制PDLSCs成骨分化,Hippo信号通路中TAZ及磷酸化TAZ表达降低,而LATS1、Mob1及磷酸化LATS1、Mob1表达升高,TEAD家族转录活性减弱。3.在Wnt3a处理的基础上,敲低TAZ的表达,可以部分抵消Wnt3a的促成骨作用,在dkk-1处理的基础上,过表达TAZ,可以部分抵消dkk-1的抑制成骨作用;慢病毒转染和rescue实验证实TAZ是经典Wnt通路下游靶点,Co-IP证实β-catenin与LATS1形成蛋白复合体。实验结论1.已证明在经典Wnt信号通路调控PDLSCs成骨分化的过程中,Hippo/TAZ信号通路中关键蛋白表达水平改变,表明经典Wnt信号通路和Hippo/TAZ信号通路都参与了 PDLSCs增殖及成骨分化活动的影响作用。2.经典Wnt信号通路介导Hippo信号通路的抑制状态来正向调控PDLSCs成骨分化,Wnt信号通路中的β-catenin通过与Hippo信号通路上游的LATS1形成蛋白复合体,促进TAZ入核转运,抑制Hippo信号通路的活化状态。