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[目的]:构建KiSS-1、p27Kip1基因腺相关病毒载体并转染骨肉瘤MG-63细胞株,观察KiSS-1、p27Kip1基因的表达,为骨肉瘤的基因治疗研究建立一个平台;研究腺相关病毒载体介导KiSS-1、p27Kip1基因体外转染后对骨肉瘤细胞的增殖和生存能力的影响,为骨肉瘤的基因治疗提供实验依据。[方法]: 1、KiSS-1、p27Kip1腺相关病毒载体构建; 2、包装、收集病毒,组化染色了解转染率; 3、测定病毒滴度,感染目的细胞; 4、病毒感染目的细胞MG63后细胞免疫组化鉴定目的基因表达; 5、细胞增殖实验、细胞周期检测分析探讨目的基因体外效应。[结果]: 1、KiSS-1、p27Kip1腺相关病毒载体构建:胎盘组织抽提总RNA并通过RT-PCR获得目的基因ORF,经TA克隆,后将目的基因连入pAAV-MCS中,送测序结果无误。2、三质粒共转染293细胞、X-gal染色观察转染率:转染镜下观察可见CPE现象;用X-gal染色后显微镜下可见大量蓝染的阳性细胞,转染率约50～60%。3、滴度测定:采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度,按公式PFU/ml=接种细胞数×稀释度×10/V (加入的病毒体积)计算病毒滴度为1.8×108PFU/ml。4、缺陷型病毒感染MG63细胞:与对照组相比较,感染组可见细胞增殖速度明显减慢,细胞飘起死亡,Laz组染色可见细胞蓝染。5、免疫细胞化学鉴定目的基因的表达:感染了AAV-KiSS-1的MG63细胞免疫化学染色,可见阳性细胞数占60%左右,细胞边界清楚,细胞胞质及细胞核着色明显,棕黄色颗粒分布均匀;感染了AAV- p27Kip1的MG63细胞染色镜下见阳性细胞数占50%左右,胞浆染色呈棕黄,分布均匀,证实这部分细胞表达重组的目的基因。6、细胞增殖曲线、细胞周期测定分析观察目的基因体外效应:分析细胞生长曲线,缺陷病毒干预组细胞增值较对照组明显减慢;流式观察感染AAV-KiSS-1组细胞周期见G2/M期细胞比例明显增高,死亡细胞数较对照组明显增多;而感染AAV- p27Kip1组S、G2期细胞比例明显降低。[结论]:1、构建了两个分别含有KiSS-1、p27Kip1基因的重组腺相关病毒载体,三质粒共转染收集到2种较高滴度和感染力的重组腺相关病毒颗粒。2、经重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后,细胞免疫组化鉴定其高表达目的基因。3、KiSS-1基因体外转染骨肉瘤细胞MG-63细胞,通过调节细胞周期, G2/M期阻滞,能够有效的抑制骨肉瘤细胞增殖,并可致其死亡。4、p27Kip1基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞,能使细胞阻滞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤细胞增殖。