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随着人类社会生产力的大幅提高及人口压力的不断增大,全球范围的淡水水体富营养化现象日趋严重,由此引起的蓝藻水华在世界范围内频繁暴发,伴随其产生的毒素与动物及人类健康的关系受到了越来越多的关注。微囊藻毒素(MCs)是淡水水体中出现频率最高、分布最广的一类蓝藻毒素,已发现的有80多种变体。
有研究表明,性腺是MC的第二大靶器官,并且MC暴露会对雄性哺乳动物产生明显的毒性效应。研究表明,MC具有生殖毒性,并且能够导致动物性腺组织损伤,但是对其潜在的分子机制并没有进行过深入的研究。我们以斑马鱼作为模型,来研究MCRR对鱼类雄性生殖腺的蛋白影响,并试图从蛋白水平去探究其生殖毒性的分子机制。我们利用双向凝胶电泳(2-DE)来检测MCRR染毒后斑马鱼性腺中蛋白表达谱的整体变化情况。研究结果将会有助于我们了解MC产生的生殖毒性的分子机制。
近年来,已有大量研究证实了MCs对鱼类和哺乳动物胚胎发育的毒性效应,流行病学资料也证明在经济发达,污染较为严重的地区的原发性肝癌的高发生率与饮用水中MCs的污染程度相关,室内动物模型实验进一步证实MCs不仅是肝脏肿瘤发生的促进剂,也是启动剂。而目前针对MCs的传代毒性和诱导导致哺乳动物子代肝脏肿瘤发生的可能的分子机制的研究并不多。因此,本文通过使用生态毒理蛋白质组学并结合生物信息学分析及相应的生理生化检测,采用子代大鼠为研究对象,探讨了MCs的传代毒性对肝脏产生影响的可能潜在分子机制和促肿瘤作用的早期的分子水平变化。
主要研究结果和结论如下:
第一部分:在本研究中,我们利用斑马鱼来评价MCRR诱导的生殖毒性。我们腹腔注射0.5LD50剂量的MCRR来观察斑马鱼性腺的蛋白表达情况。MCRR能够引起性腺亚显微结构明显的损伤,细胞间隙明显增大,线粒体肿胀。MCRR同样引起性腺快速的反应来抵御这种氧化损伤。这是第一次运用蛋白组学的方法来研究MCRR对斑马鱼性腺整体蛋白水平的研究。结果显示处理组与对照组相比,有100个蛋白点的表达发生了明显的上调或者下调。我们从中鉴定出了24个蛋白点,其中有16个蛋白表达上调,8个蛋白表达下调。这些蛋白涉及到细胞骨架的维持、氧化胁迫相关蛋白、糖类代谢、钙信号转导、蛋白折叠、蛋白降解、翻译等生物学过程。总而言之,MCRR对性腺有毒性作用,是通过氧化胁迫对雄性斑马鱼的生殖系统产生毒性作用。
第二部分:我们采用了毒素浓度(10μg/kgMCLR/day)对母鼠从怀孕后第8天开始持续进行染毒到子鼠出生后16天左右(染毒28天),我们检测利用2-DE技术对子代小鼠肝脏进行蛋白质组学分析,并检测了子代肝脏的显微结构和亚细胞结构变化,氧化水平的变化(脂质过氧化和活性氧的变化水平)及蛋白磷酸酶活性变化情况,检测了MCLR在子代肝脏中累积含量。
蛋白组学研究发现MCLR处理组相比对照组共有45个蛋白点的表达量发生了显著变化(≥1.9倍或者≤0.5倍;p<0.05),经过MALDI-TOF-TOFMS分析,对这些表达发生变化了的蛋白点进行确认,并利用NCBI和MASCOT数据库对匹配的蛋白点进行查询,我们确认了40个不同的蛋白点,但是有6个点检测出是同一个蛋白。在这其中有19个蛋白点在MCLR处理后表达显著上调,16个蛋白表达显著下调。这些差异表达的蛋白质种类涉及到多种生物学过程例如细胞通讯、能量代谢、离子平衡、应激响应、生物过程调控等。我们将这些差异表达的蛋白质功能进行分类,主要集中在细胞骨架、氧化胁迫、代谢等方面。其中3个蛋白(TGM2,MAT1A,PPm1a)与肝脏细胞增殖和癌症发生有密切相关的蛋白尤其值得注意。
除此之外,我们发现肝脏细胞间隙明显增大,ROS和MDA的含量在MCLR暴露后有明显上升,GSH含量明显下降表明子代肝脏受到明显的氧化损伤。围产期的MC暴露使得子代肝脏的结构受到破坏,并在子代检测出毒素说明MC暴露具有传代性,这些结果更加证明了监测MC对哺乳动物子代的影响的必要性,更要考虑到藻毒素可能通过母体传递可能造成的影响以及可能对人类的影响。