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背景与目的:胃癌(Gastric cancer,GC)是癌症相关死亡的主要原因之一,根据美国癌症协会的统计,胃癌的发病率在消化系统癌症中排名第五。与此同时,据估计,在东亚地区胃癌是第二常见的癌症,在与肿瘤相关的死亡中,无论男女胃癌都排在第三位。近年来的统计结果显示,胃癌的发病率在世界范围内逐渐升高。双硫仑(Disulfide,DSF)由于其对乙醛脱氢酶的抑制作用而被用作抗酒精依赖性药物。近年来,DSF在乳腺癌、骨髓瘤、胰腺癌等恶性肿瘤中的潜在靶向作用已被临床前研究发现。此外,有报道称DSF具有逆转耐药、抑制DNA甲基化、诱导细胞凋亡等作用。然而它对胃癌的影响尚未阐明。因此,本研究旨在观察DSF对GC细胞增殖、迁移和侵袭的影响,进一步探索其作用的信号通路和分子机制。第一部分双硫仑对胃癌细胞的抗肿瘤活性研究研究目的:使用DSF处理胃癌细胞,通过CCK8,Transwell等细胞生物学检测手段,验证DSF抑制胃癌细胞MKN-45和SGC-7901增殖、迁移和侵袭的作用。研究方法:(1)人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞体外培养。(2)采用CCK8实验检测DSF对人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞增殖的影响。(3)采用Transwell小室进行迁移检测,观察DSF对人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞迁移能力的影响。(4)采用Transwell小室和基质胶进行侵袭检测,观察DSF对人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞迁移能力的影响。(5)使用ELISA试剂盒检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的表达水平以及迁移、侵袭标志物MMP2的表达水平,评估DSF对细胞增殖及迁移、侵袭的抑制作用。结果:CCK8实验结果表明DSF能够显著抑制人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞的增殖水平,并且抑制作用呈剂量依赖性,即使低浓度的DSF也表现出了对人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞增殖的抑制作用,半数抑制浓度约为50μmol/L;DSF能够降低增殖标志物蛋白PCNA的表达水平。Transwell实验证明DSF能够抑制胃癌细胞迁移及侵袭能力,同时DSF能够降低迁移、侵袭标志物蛋白MMP2。结论:DSF的干预抑制了人胃癌MKN-45和SGC-7901细胞的增殖能力及迁移、侵袭水平,表明DSF具有一定的抗癌潜力。第二部分双硫仑抗肿瘤靶点生物信息筛选研究目的:本实验通过使用网络药理筛选法探究DSF的药理作用和潜在的分子靶点,并通过蛋白质之间相互作用分析、通路富集对接工具等对相关靶点进行优化,更好地阐明DSF抗肿瘤作用分子机制。研究方法:(1)通过药物在线数据库对DSF可能的药理靶点进行初步分析预测,最后通过匹配程度进行排序。(2)通过蛋白质互作网络(Protein-protein interaction,PPI)在线分析数据库对DSF与胃癌共有靶点蛋白进行PPI网络构建和分析,并筛选枢纽蛋白用于后续分析。(3)利用Davaid 6.7平台对DSF和GC的潜在共有靶点进行KEGG通路和GO生物学功能富集分析,筛选出相关信号通路,为后续实验提供依据。结果:(1)经过数据库初步筛查,我们获得了DSF的靶点信息,通过进一步分析,我们确定了38个分子靶点。(2)通过使用PPI分析了目标分子靶点之间的相互作用,结果表明KAT1、MTOR、BCL2L1、RELA和MAPK8靶点蛋白评分值排名靠前,为5个关键靶点。(3)KEGG通路富集分析DSF的潜在靶点涉及基因表达、信号转导、细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期和系统免疫等多个生物过程。取前20条通路的富集,主要涉及肿瘤相关通路、炎症相关通路及细胞信号转导相关通路等,其中靠前的有Wnt和NF-κB通路。(4)GO分析,根据P值得到基因GO本体条目298条(P<0.05)。DSF的潜在靶点主要涉及遗传、细胞凋亡、细胞炎性反应、细胞增殖、细胞迁移、激素应激反应等方面。结论:分析结果表明,DSF能够在细胞内作用于多条通路,并且这些通路大多与癌症的发生发展相关。我们通过PPI分析并筛选枢纽蛋白,结果表明DSF能够作用于这些靶点蛋白;KEGG通路富集分析显示Wnt和NF-κB可能是DSF抗肿瘤作用的关键靶点。第三部分双硫仑通过Wnt和NF-κB通路对胃癌细胞表型的影响研究目的:对DSF与Wnt和NF-κB通路相关蛋白作用做进一步验证,论证DSF抗肿瘤作用的分子机制。研究方法:(1)ELISA法检测DSF对Wnt和NF-κB蛋白通路相关蛋白的表达水平。(2)qRT-PCR检测DSF对Wnt、β-catenin和NF-κB表达水平的影响。(3)WB法检测DSF对Wnt和NF-κB蛋白通路相关蛋白表达水平的影响。结果:ELISA法检测DSF能够抑制Wnt和NF-κB蛋白通路相关蛋白的表达,并且存在剂量依赖效应。WB实验结合ELISA结果证实DSF通过Wnt和NF-κB通路调控胃癌的增殖、迁移、侵袭,并且随浓度的增加,抑制作用更明显。结论:DSF通过抑制Wnt和NF-κB蛋白通路相关蛋白的表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭。