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目的:前期研究结果表明,钉螺头足部组织浸出液(protein extract from head-foot tissue of Oncomelanian hupensis,PhfO)具有促进共培养日本血吸虫母胞蚴生长发育的功能,但其潜在的分子调控机制尚不明确。果糖二磷酸醛缩酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase,ALD)是糖酵解过程中的重要裂解酶,参与日本血吸虫的能量代谢,在PhfO共培养母胞蚴体内呈差异性上调表达,可能是调控母胞蚴生长发育的关键基因。本课题在此基础上,进一步研究PhfO调控虫体ald基因促进共培养母胞蚴生长发育的作用机制。方法:利用体外建立的PhfO与日本血吸虫母胞蚴共培养体系,定期观察、记录PhfO共培养组和对照组母胞蚴的生长发育情况,测量其体长、体宽,计算各组母胞蚴的体积和存活率,同时检测各组母胞蚴ATP代谢水平的变化。采用分子克隆方法,构建PET28(a)-Sjald的重组表达质粒,原核表达ALD蛋白,蛋白纯化后免疫家兔,获得ALD免疫血清。免疫荧光组织化学染色检测ALD蛋白在母胞蚴体内的分布和表达。培养第3、4、5和8天,real-time PCR和免疫荧光组织化学染色分别检测共培养母胞蚴体内ald mRNA及ALD蛋白表达的变化。设计并合成Sjald siRNA,浸泡法饲喂培养母胞蚴,敲低ald基因的表达,检测母胞蚴的生长发育、ATP代谢水平及存活率等变化。利用RNAi技术,干扰PhfO共培养母胞蚴ald基因,干扰后第6天,检测共培养母胞蚴的ATP消耗水平、Sjald mRNA转录水平及ALD蛋白表达的变化,同时测量和记录各组母胞蚴体长、体宽、体积和存活率变化。结果:PhfO共培养后,该组母胞蚴与对照组母胞蚴比较,虫体明显变长、变宽、体积变大,存活率增加,ATP代谢水平显著升高。培养第3天到第8天,共培养组母胞蚴的体长、体宽和体积分别从97.42±7.65μm增加到114.40±8.78μm、47.33±5.37μm增加到51.74±6.29μm、144983±33834μm~3增加到207231±59232μm~3,而对照组母胞蚴体长从93.34±8.99μm增加到102.3±7.51μm、体积从145231±34030μm~3增加到161529±32410μm~3,体宽变化不大,分别为49.04±7.00μm和48.75±4.70μm。第8天时共培养组母胞蚴的存活率为92.91%,较对照组母胞蚴存活率为81.54%明显增加(p<0.05)。培养第3天起,共培养组母胞蚴的ATP代谢水平即开始显著升高,第8天时,其ATP代谢水平约为对照组母胞蚴的20倍(p<0.05)。免疫荧光组织化学染色结果显示,母胞蚴体内的ALD蛋白呈红色颗粒状或团块状荧光,表达于细胞质,主要分布于母胞蚴体内细胞或体壁。PhfO共培养第5天和第8天,共培养组母胞蚴ald mRNA的表达水平明显升高(p<0.05);第8天时,共培养母胞蚴体内的ALD荧光颗粒信号强度较第3天时显著增加。母胞蚴RNAi实验结果显示,Sjald siRNA可以敲低母胞蚴ald mRNA的表达,抑制率达72%;敲低ald基因后,母胞蚴体内的ALD蛋白荧光信号明显降低,ATP代谢水平下降60%(p<0.05);干扰后第10天与第3天比较,siRNA to ald干扰组母胞蚴逐渐变小、缩短,体长从97.73±9.45μm减少到77.31±7.79μm、体宽从46.34±4.85μm减少到42.56±4.32μm、体积从139500±29504μm~3减小到90909±22626μm~3,而Control siRNA对照组母胞蚴则逐渐变大、变长,体长从96.53±9.65μm增加到105.49±6.19μm、体宽从45.34±6.61μm增加到50.98±6.10μm、体积从132321±35505μm~3增加至182844±44689μm~3,两组母胞蚴体长、体宽和体积变化均具有统计学差异(p<0.05);干扰第10天,siRNA to ald组的母胞蚴存活率也显著下降(p<0.05)。PhfO共培养母胞蚴的RNAi实验结果显示,敲低ald后,共培养母胞蚴体内上调表达的ald mRNA转录水平和ALD蛋白表达水平明显随之下降(p<0.05);干扰后第6天,1%PhfO+siRNA to ald组母胞蚴的ATP代谢水平较1%PhfO+Control siRNA组母胞蚴下降26%(p<0.05);第10天时,1%PhfO+siRNA to ald组幼虫的生长速度明显较未干扰1%PhfO+Control siRNA组减慢,与第3天比较,1%PhfO+siRNA to ald组母胞蚴的体长从100.02±11.27μm减小至92.37±8.16μm、体宽从49.69±5.30μm降低到47.99±3.95μm、体积从160474±33551μm~3减小至138387±23785μm~3,而1%PhfO+Control siRNA组母胞蚴的体长从99.53±10.83μm增长至119.66±6.96μm、体宽从47.79±6.81μm增宽至56.34±4.57μm、体积从150139±38629μm~3增大至252849±41534μm~3;干扰过程中,1%PhfO+siRNA to ald组母胞蚴的存活率与Control siRNA对照组母胞蚴相似,均呈逐渐下降趋势,至第10天时存活率降至78%,而1%PhfO+Control siRNA组母胞蚴则一直保持约95%较高的存活率。结论:钉螺头足部组织浸出液(PhfO)具有促进日本血吸虫母胞蚴的生长发育、提高虫体存活率,并增加其ATP代谢水平的作用;PhfO能上调共培养母胞蚴ald基因和蛋白的表达。ALD蛋白表达于日本血吸虫母胞蚴的细胞质,主要分布于虫体内部细胞和体壁。ald基因具有提高虫体ATP代谢水平、促进日本血吸虫母胞蚴的生长发育、提高其存活能力的作用。PhfO通过上调共培养虫体ald基因的表达,提高日本血吸虫母胞蚴的ATP代谢能力、促进其生长发育、提高其存活能力。