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目的乳腺癌具有很强的侵袭性和转移性,是全球女性癌症相关死亡的主要原因。虽然外科手术、化学疗法、内分泌治疗、靶向治疗和放射疗法的显著进步有助于原发性肿瘤的根除,但高复发率和耐药性严重影响了乳腺癌患者的预后。因此,探索乳腺癌发生发展的分子机制,筛选新的有效治疗靶点及预后标志物,对于提高乳腺癌患者的治疗效果和生存率具有重要的现实意义。驱动蛋白KIF15,又称为Hklp2,为驱动蛋白超家族成员之一,主要参与细胞内有丝分裂、减数分裂和大分子的运输,在肿瘤耐药性中起到重要作用。KIF15的异常表达可能会引起细胞内遗传物质分布异常从而导致肿瘤的发生发展。我们前期研究发现KIF15在乳腺癌组织内高表达并与预后密切相关,这提示KIF15可能是乳腺癌发生发展中的重要因子。因此,KIF15或许能成为乳腺癌未来靶向治疗的有效潜在靶点。microRNA（miRNA）是一类单链、内源性非编码RNA,通过与靶基因mRNA3’端非翻译区（3’-UTR）的靶序列互补配对结合,导致mRNA降解或翻译抑制,调控基因转录过程。研究表明多种miRNAs参与乳腺癌的发生、发展以及侵袭。本研究通过对乳腺癌及癌旁组织中KIF15表达的检测,分析其与乳腺癌患者临床病理特征的关联性。运用生物信息学和体外实验初步探索上游miRNA靶向KIF15对乳腺癌细胞生物学的影响。通过体外和体内实验,研究KIF15下调后对乳腺癌细胞增殖、迁移的影响,在一定程度上阐明KIF15调控乳腺癌细胞增殖迁移的分子机制,明确其在乳腺癌的发生、发展中的具体意义,靶向KIF15可能是乳腺癌治疗的有效策略。方法1、KIF15在乳腺癌组织中的表达及临床意义:采用RT-qPCR、免疫组化对55例乳腺癌组织及其对应的癌旁组织中KIF15mRNA和蛋白的表达进行检测,分析KIF15表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性。Kaplan-Meier整体生存分析探究KIF15表达与乳腺癌预后的关系。2、KIF15上游调控miRNA的预测验证及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响:应用Targetscan和miRDB数据库预测靶向KIF15的miRNAs,双荧光素酶报告基因实验初步筛选验证miRNA及结合位点。miR-578靶向抑制KIF15的作用最明显,CCK-8、平板克隆及Transwell实验检测miR-578靶向KIF15对乳腺癌细胞增殖、迁移能力的影响。3、KIF15下调对乳腺癌细胞生物学行为的影响:RT-qPCR和Western blotting检测siRNA转染后乳腺癌细胞中KIF15的表达水平。CCK-8、EdU细胞增殖、软琼脂细胞克隆、平板克隆及Transwell等体外实验检测KIF15下调后乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。Western blotting 检测 KIF15 下调后 AKT、p-AKT、JNK、p-JNK、p53、PTEN、Cyclin D1、p21及Cleaved-Caspase3等功能蛋白表达变化情况。构建裸鼠皮下成瘤模型和小鼠肺肿瘤模型,观察分析KIF15下调后乳腺癌细胞皮下成瘤能力和肺部肿瘤形成能力。结果1、KIF15在乳腺癌组织中的表达及临床意义:乳腺癌组织中KIF15 mRNA和蛋白的表达较癌旁组织明显增高,差异有统计学意义（P＜0.01）。KIF15表达与肿瘤大小（P=0.009）、淋巴结转移（P=0.046）和TNM分期（P=0.005）有显著相关性,而与年龄、Her-2、ER和PR状态无相关性（P＞0.05）。Kaplan-Meier整体生存分析显示,乳腺癌组织中KIF15表达越高,乳腺癌患者预后越差。2、KIF15上游调控miRNA的预测验证及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响:生物信息学分析筛选出靶向KIF15的前10个候选miRNAs,RT-qPCR和WB发现miR-578 mimics 转染 MDA-MB-231 细胞后 KIF15 mRNA 和蛋 白的表达抑制最明显。双荧光素酶报告基因证实miR-578与KIF15-3’UTR的特定位点结合从而抑制KIF15的表达。KIF15蛋白表达量随着miR-578转染剂量增加而降低。CCK-8细胞增殖实验显示miR-578 mimics 显著抑制 MDA-MB-435S、MCF7 和 MDA-MB-231 细胞的增殖能力。平板克隆实验发现 miR-578 mimics 抑制 MDA-MB-435S、MCF7 和 MDA-MB-231 细胞的集落形成能力。Transwell细胞迁移实验显示miR-578 mimics抑制MDA-MB-435S、MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移能力。3、KIF15下调对乳腺癌细胞生物学行为的影响:成功设计si-KIF15序列,Western blotting 和 RT-qPCR 证实转染 siRNA 后,乳腺癌细胞 MCF7、MDA-MB-435S及MDA-MB-231中KIF15 mRNA和蛋白的表达明显受到抑制（P＜0.05）。CCK-8细胞生长曲线显示,KIF15下调显著降低MCF7、MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞的增殖率（P＜0.05）。EdU细胞增殖实验显示MDA-MB-231细胞KIF15下调后显著抑制细胞增殖能力（P＜0.05）。软琼脂细胞克隆实验和平板克隆实验显示KIF15下调后乳腺癌细胞生长和集落形成能力明显下降（P＜0.05）。Transwell细胞迁移实验显示MDA-MB-231、MDA-MB-435S和4T1细胞KIF15下调后,乳腺癌细胞迁移能力受到抑制（P＜0.05）。Western blotting 结果显示,MCF7 和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中 KIF15下调后明显抑制AKT和JNK的磷酸化,降低了 Cyclin D1的表达,而p53、p21蛋白表达增加,Cleaved-Caspase3等无明显变化。成功建立裸鼠皮下成瘤模型,慢病毒转染MDA-MB-231细胞后通过荧光显微镜观察到两组细胞内均有绿色荧光。Western blotting显示MDA-MB-231/LV-shKIF15-1组KIF15蛋白表达水平显着降低。肉眼观察到NC组裸鼠全部皮下成瘤,KIF15低表达组三只裸鼠皮下成瘤,NC组裸鼠皮下肿瘤明显大于KIF15低表达组的皮下肿瘤,KIF15低表达组的裸鼠皮下肿瘤重量明显轻于NC组。成功建立小鼠肺肿瘤模型,大体形态观察、HE染色和免疫组化证实小鼠肺组织中存在肿瘤。3周后称重小鼠显示KIF15低表达组小鼠明显比NC组小鼠重。KIF15低表达组的肺肿瘤数明显少于NC组,KIF15低表达组的肺肿瘤重量轻于NC组。免疫组化显示KIF15下调后,KIF15低表达组肺肿瘤KIF15、Vimentin表达降低,KLF4、E-cadherin表达升高。Western blotting和免疫组化检测AKT、p-AKT、JNK、p-JNK、p53、PTEN、Cyclin D1、p21 及 Cleaved-Caspase3 等功能蛋白在小鼠肺肿瘤中的表达,结果与体外实验一致。结论1、KIF15在乳腺癌组织中表达显著增高,KIF15表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈正相关,与年龄、Her-2、ER和PR状态无关,KIF15高表达预示乳腺癌患者预后不良。2、生物信息学和细胞实验表明KIF15是miR-578下游靶基因,miR-578 mimics靶向KIF15抑制乳腺癌细胞的增殖迁移能力。3、KIF15下调后有效抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,KIF15下调后有效抑制MDA-MB-231细胞的皮下成瘤能力,KIF15下调后抑制4T1乳腺癌细胞的在小鼠肺部的生长能力。KIF15下调后影响细胞周期、增殖和凋亡相关的功能蛋白表达,KIF15可能参与肿瘤相关信号通路的激活。