γδT细胞兼具特异性和非特异性免疫应答双重特征，其在机体免疫应答中所处的进化地位和生物学意义与功能有待于进一步阐明。因此，揭示γδ抗原识别受体(TCR)抗原识别的规律，将有助于对上述理论问题进行澄清，并可为免疫学应用提供新的策略与手段。 本论文旨在研究γδT细胞对热休克蛋白(HSP)的识别机制和探讨乙型肝炎病毒感染患者TCRVδ2的抗原识别机理，以及以TCRCDR3δ为探针筛选和鉴定γδTCR识别的表位多肽。 (一)人类γδT细胞对细胞表面热休克蛋白(membraneHSPs)识别机制的研究热休克蛋白在免疫应答中主要作用包括：1)与表位肽形成HSPs-peptide复合物，表达在细胞表面，参与抗原提呈过程；2)作为靶分子直接为免疫细胞所识别，诱导产生免疫应答。针对上述问题，本文首先重点研究了在γδT细胞识别HSP分子的过程中，HSP分子究竟是作为抗原提呈分子还是作为抗原这一基本问题，继而初步探讨了HSP分子和γδT细胞相互作用的生物学意义。为此，首先我们以EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞(LCL细胞)作为细胞模型，探讨了细胞转化这一应激事件对细胞膜表面HSP分子表达水平的影响；其次应用siRNA干扰技术，分别敲除HSP60和HSP70分子，观察LCL细胞上述基因表达水平与γδT细胞对LCL细胞毒活性间的相关性；最后，利用体外增殖实验，探讨HSP分子是否对γδT细胞具有直接刺激作用。研究结果显示，在LCL细胞表面，HSP60和HSP70分子均可在转化应激的诱导下表达增高。HSP70分子表达下调后，γδT细胞对自体和异体来源的LCL细胞毒活性均受到抑制，与对照组相比具有显著统计学意义(P＜0.05)，而HSP60分子表达水平对γδT细胞杀伤活性的影响较小。[3H]-TdR掺入实验证实了HSP72分子可以直接刺激γδT细胞发生增殖。上述结果不仅在理论上支持了γδT细胞通过直接识别HSP分子参与早期免疫应答，尤其在对肿瘤的免疫监视，同时也为以HSP70分子(尤其是HSP72分子)为佐剂，辅助γδT细胞介导的免疫治疗提供了依据。目前，上述结果所形成的论文已被“ImmunologicalInvestigations”接收。 (一)HBV慢性感染患者TCRVδ2抗原识别的结构基础与相应抗原识别表位多肽的筛选与鉴定 其具体研究内容为：γδTCR中δ链的CDR3区在抗原识别中的作用，并分析其中的关键序列；然后利用人工合成的CDR3δ多肽在噬菌体肽库筛选相应的抗原表位多肽。 我们首先选择慢性HBV慢性感染(CHB)患者作为研究对象，通过RT-PCR，从CHB患者外周血的γδT细胞中，扩增其抗原识别受体(γδTCR)V区并进行测序。通过与GenBank现有序列对比进行分析，了解CHB患者外周血γδTCRV区序列特征。结果提示CHB患者TCRVδ2CDR3长度保守；基因组成以V1D3J1为主，其中D3片段读码框优势取用“LGDT”；而在N/P位点中，F-7位中性氨基酸(GAVLI)的取用少于对照组。 其次，我们利用人工合成CHB患者来源的CDR3δ肽，研究其与HBV感染肝组织或者HBV感染肝细胞模型的结合特异性。结果表明，含有保守序列的CDR3δ合成肽(CH1)可以与HBV感染肝组织以及HBV感染肝细胞模型2.2.15细胞发生特异性结合，而与正常肝组织则无结合反应。为进一步研究组成CDR3δ的各基因片段的编码产物(V、D和J片段)在抗原识别中的作用，我们合成了用随机序列替换上述片段的对照肽Vm、Dm、Jm和VJm。通过激光共聚焦显微镜分析和SPR技术分析，发现Vm和VJm突变肽几乎不与2.2.15细胞结合，而Dm和Jm与2.2.15细胞的结合水平与CH1基本相当。这一结果提示CDR3δ的侧翼序列在抗原识别中起决定性作用。 最后，我们以CDR3δ合成肽为探针，在噬菌体展示肽库(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibrary)中进行了抗原表位多肽的筛选，获得了八条特异结合的肽片段。经过ELISA验证和生物信息学分析，选择合成了其中两条进行了初步的功能研究。这两条多肽的序列分别为“WHWTNWGKTSPA”和“HWFNWLRSDSRS”。结果显示上述两条多肽均可使人类外周血单个核细胞(PBMCs)中的γδT细胞群体得以数量上的扩增，提示它们具有γδT细胞所识别表位多肽的特性。 上述结果不仅阐明了CDR3区在抗原识别中的关键性意义，为γδTCR有限多样性识别理论提供了实验依据，同时还为应用上述理论建立了筛选感染相关抗原表位的方法，并且为治疗感染性疾病，尤其是那些对特异性免疫系统存在耐受的病毒感染提供新策略。