【摘 要】
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蓝藻是重要的全球初级生产者,其每年固定的二氧化碳量约占全球光合碳固定量的25%。而蓝藻普遍分布在寡营养的海洋环境中,其生长受到很多环境因子的限制。有研究表明,缺铁限制了全球约三分之一海洋的初级生产力。为了应对环境铁限制情况,蓝藻进化出很多适应性策略,主要包括(1)合成与分泌三价铁螯合物,辅助铁吸收;(2)上调铁吸收相关基因的表达,增加铁吸收;(3)诱导表达保护蛋白IsiA(Iron stress-
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蓝藻是重要的全球初级生产者,其每年固定的二氧化碳量约占全球光合碳固定量的25%。而蓝藻普遍分布在寡营养的海洋环境中,其生长受到很多环境因子的限制。有研究表明,缺铁限制了全球约三分之一海洋的初级生产力。为了应对环境铁限制情况,蓝藻进化出很多适应性策略,主要包括(1)合成与分泌三价铁螯合物,辅助铁吸收;(2)上调铁吸收相关基因的表达,增加铁吸收;(3)诱导表达保护蛋白IsiA(Iron stress-induced protein A),增加对光能的捕获;(4)利用非铁蛋白代替含铁蛋白,减少细胞对铁的需求量;(5)通过储铁蛋白,在高铁时储存铁,低铁时释放铁。但有关蓝藻是如何感受缺铁信号,并对缺铁做出响应的机制并不清楚。本研究发现模式蓝藻——集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803中具有三个同源的、缺铁上调表达的转录调控因子:S111205、S111408、Slr1489,其编码基因在基因组上分布于TonB系统(外膜铁吸收系统)中的TBDT(外膜铁转运蛋白)编码基因附近。它们可能在蓝藻的缺铁信号转导过程中发挥重要功能,将这三个转录因子归为一类转录因子并命名为IutR(Iron uptake transcription regulator),并开展了一系列的研究。取得的主要研究结果如下:1、转录因子IutR单突变株、三突变株、互补株构建及生理表型测定。生物信息学分析表明,S111205、S111408、Slr1489具有典型的转录因子结构域,在蓝藻中具有广泛的分布。将它们分别编号为IutR1、IutR2和IutR3,对这三个IutR分别敲除并进行生理测定发现,三个IutR单突变株的生理表型无论在铁丰富或者铁缺乏时,都与野生型没有显著差异。进一步对这三个转录因子进行了组合敲除,得到三个IutR均敲除的三突变株。实验数据表明,在铁丰富情况下IutR三突变株的生长与野生型无显著差异;但是在铁不足情况下,IutR三突变株的生长比野生型显著减慢,说明三突变株对缺铁十分敏感。为了排除敲除过程中的第二点突变及极性效应,继续构建得到单个转录因子IutR互补IutR三突变株的互补株。研究发现,单个IutR能够部分互补三突变株的缺铁敏感表型,并且IutR1(S111205)的互补效果最为明显。互补实验数据排除第二点突变与极性效应对IutR三突变株的影响,进一步证明转录因子IutR对集胞藻PCC 6803的缺铁响应具有重要作用。2、转录因子IutR在蓝藻适应缺铁环境中的调控机制研究。荧光定量PCR实验数据表明,三个IutR单突变株中TonB系统内的铁吸收基因受缺铁诱导上调幅度有所下降;而在IutR三突变株中,TonB系统、FeoB(内膜上的二价铁转运子)、Fut系统(内膜三价铁转运系统)内的铁吸收基因的缺铁诱导表达受到显著抑制,其中TBDT编码基因表达受抑制程度最为明显。进一步采用酵母单杂交与凝胶阻滞实验来验证转录因子IutR与tbdt启动子的结合,酵母单杂交实验表明,转录因子IutR1(Sll1205)与sll1206(tbtd1)、slr1490(tbtd4)的启动子区结合;转录因子IutR2(Sll1408)与sll1206(tbtd1)、sll1409(tbtd3)的启动子区结合;转录因子IutR3(S111489)与slr1490(tbtd4)的启动子区结合。凝胶阻滞实验表明,IutRl与四个tbtd的启动子区均具有结合;IutR2与sll1206(tbtd1)、sll1406(tbtd2)、Slr1490(tbtd4)的启动子区结合;IutR3与sll1406(tbtd2)、slr1490(tbtd4)的启动子区结合。以上结果说明,IutR能够直接调控tbdt基因等铁吸收相关基因的表达。此外有实验结果表明,三个IutR之间不具有相互作用,说明它们可能并不以复合体方式发挥功能。3、转录因子IutR调控靶基因的筛选。构建IutR1-3Flag互补IutR三突变的互补株进行Chip-seq实验,鉴定集胞藻PCC 6803在缺铁条件下,转录因子IutR1直接结合的靶标基因。实验数据表明IutR1结合的靶基因较多,这些基因主要涉及胞内氨基酸合成、碳代谢、及铁吸收等多个生理代谢过程。其中铁吸收的基因主要包括:TonB依赖的外膜铁吸收系统TBDT1、TBDT2、TonB的编码基因,质膜三价铁吸收系统FutA1、FutA2、FutB、FutC的编码基因,以及Fec铁吸收系统(内膜上的三价螯合铁吸收系统)中的FecB、FecD、FecE的编码基因,与之前实验数据基本相符。这也证明,IutR转录因子能够直接对外膜铁吸收系统(如TBDT编码基因)的表达进行调控,并且也有可能调控三价铁吸收的Fut系统与Fec系统。
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