论文部分内容阅读
目的: 在前期的研究中,我们发现miR-4530能够抑制乳腺癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡而且具有促进血管形成的功能。本研究旨在通过对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的miR-4530进行高表和低表,探究miR-4530对HUVEC s的细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等功能的影响,并通过靶基因预测及相关通路关键蛋白的检测初步探究 miR-4530调控细胞功能的相关机制,从而为 miR-4530作为一种新型抗肿瘤药物的研究提供相关理论基础。 方法: 1)我们通过对HUVECs中的miR-4530进行干扰以及筛选,构建了稳转的细胞株,包括高表达株、低表达株以及空载对照细胞株。 2)测定miR-4530干扰后细胞的各项功能,包括细胞增殖(CCK8、克隆形成)、细胞周期和凋亡。 3)通过Targetscan预测miR-4530的靶基因,并采用双荧光素酶报告实验验证其靶基因,对干扰株中靶基因的mRN A和蛋白水平进行检测。 4)通过质粒转染将正常的HUVECs中的RASA1进行高表达,筛选、检测后构建稳转细胞株以及阴性对照组。测定两组细胞株的细胞增殖和细胞凋亡的变化情况。 5)Western Blot检测ERK/MAPK通路和PI3K/AKT通路中的关键蛋白,并分别将两条通路抑制剂加入 miR-4530稳转细胞株中检测细胞凋亡和细胞增殖的变化。 结果: 1)通过荧光定量检测转染后的单克隆细胞株miR-4530的表达量,成功筛选出稳定干扰的细胞株。 2)高表达 miR-4530后,HUVEC细胞株表现为增殖能力降低,凋亡比率增加, RASA1的mRNA和蛋白表达水平都显著升高;低表达miR-4530后,细胞增殖能力增强,凋亡变化不明显,RASA1的mRNA与蛋白表达水平均有所的降低。 3)高表达RASA1后,通过荧光定量和WB检测转染后的单克隆细胞株,筛选出了稳转细胞株。相较于阴性对照组,RASA1高表达后HUVEC细胞株的细胞增殖能力明显降低,凋亡比率显著增加。 4)miR-4530稳转的细胞株提取蛋白后,通过WB检测发现总AKT、RAS没有明显变化,pS473AKT、pT308AKT、BCL-2、p-ERK蛋白的表达量相较于对照组均显著下降,BAX蛋白的表达量显著增加。 5)在miR-4530稳转细胞中加入PI3K/AKT通路抑制剂,发现HUVEC细胞的凋亡比率随着抑制剂浓度升高而增加且三组(高表、低表、空白对照)之间的差距越来越小;加入ERK/MAPK通路抑制剂,HUVEC细胞株的增殖能力随着抑制剂浓度升高而下降且组间差距也越来越小。 结论: 1) MiR-4530高表达后其通过上调RASA1的表达,抑制了细胞的增殖能力且促进了细胞的凋亡。 2) RASA1是miR-4530的靶基因之一; miR-4530通过影响RASA1的表达从而影响细胞的增殖和凋亡。 3) MiR-4530影响细胞增殖和 ERK/MAPK通路有关,影响细胞凋亡则与PI3K/AKT通路有关。