在神经系统的研究中,获得完整的神经解剖学结构被认为是理解大脑功能和神经精神疾病的基础。因此,在欧美中日等国开展的脑计划中,常将高分辨大尺度的哺乳类动物全脑图谱绘制,作为优先部署的领域。组织透明化技术是近年来发展起来的进行组织三维成像的新技术。该技术通过采用多种不同的策略降低生物组织对光的衰减,可以完成小鼠全脑的透明化,进而获取大体积样本精细三维结构,为在三维水平研究生物组织的结构提供了强有力的工具。目前大多数透明化方法的应用范围多是大体积组织样品,通常需要采用相对剧烈的处理条件及数天至数周的处理时间,以完成组织的透明化,存在操作复杂、耗时长、荧光标记淬灭和试剂的毒性等问题,制约了组织透明化技术的广泛应用。高尔基染色是对啮齿类动物、非人灵长类动物以及人脑神经元进行精细结构标记的经典方法。虽然目前已有数种组织透明化方法被用于高尔基染色组织的透明化之中,但现有方法的处理时间较长并且未进行详细的免疫染色测试,使得难以在高尔基染色组织上进行高效的细胞类型特异性的形态学研究。针对以上问题,本研究旨在建立适用于大体积脑结构三维解析的超快速组织透明化技术。主要结果如下:为了对较厚的组织切片进行快速透明化以用于三维成像,通过测试多种试剂的组织透明化效果,本研究研发了一种由硫二甘醇、二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷和山梨醇组成的组织透明化试剂。该试剂是一种无毒的碱性溶液（alkaline solution,AKS）,通过一步法浸泡,可使300 μm和1 mm厚度的组织切片在5分钟或1小时内完成透明,而常规透明化方法则需要多个操作步骤、数小时乃至数天的处理时间。与现有透明技术相比,本方法极大降低了组织透明化的操作难度并提升了效率,为临床病理样本的处理,提供了可能的方案。同时,经过AKS处理后的多种荧光蛋白的信号明显强于其它透明化方法处理后的组织,可用于低亮度荧光蛋白标记样品的长时程高分辨率成像。此外,AKS与多种用于免疫荧光染色、环路追踪、组织结构及形态标记的荧光染料相兼容。通过将AKS应用于多种类型荧光蛋白及荧光染料标记样本的快速透明化,实现了小鼠大脑及外周组织的三维成像、长距离神经纤维追踪、核团尺度的大体积样品的三维成像和分析、神经环路追踪及空间共定位分析、神经细胞形态重构以及人脑病理样本的三维成像。历经百年的验证,高尔基染色方法仍然是描述神经元结构、特别是树突和轴突以及树突棘最经典的方法。为了使高尔基染色适合于组织透明和三维形态学分析,通过优化Golgi-Cox染色、组织透明化及三维免疫染色条件,本研究研发了一种通过聚电解质水凝胶包埋实现Golgi-Cox染色组织膨胀及快速透明化的方法。该方法可以在6 h内完成1 mm厚度的Golgi-Cox染色组织的透明化,同时保留Golgi-Cox染色的信息。透明后的Golgi-Cox染色组织可以进行三维成像并且与免疫染色相兼容。本研究使用该方法首次实现了 Golgi-Cox染色组织的三维免疫染色和多轮免疫染色。通过结合Golgi-Cox染色和组织透明化及免疫染色技术,在小鼠的Golgi-Cox染色组织上实现了毫米尺度的大体积的三维成像、特定细胞类型的免疫染色、多轮免疫染色和在树突棘水平进行神经环路的重建。同时,上述方法在人脑组织样本中也得到了验证。结论:基于碱性溶液的组织透明化技术可用于快速获取细胞形态的三维数据,改良膨胀法可实现高尔基染色组织的透明化,为揭示神经系统的精细三维结构提供了新的方法学支持。