鲍曼不动杆菌B内酰胺酶分-7：流行病学的研究 鲍曼不动杆菌是一种常见的条件致病菌，近年来已成为院内感染主要的病原菌之一，特别是引起重症监护病房内的爆发流行。该菌耐药情况相当严重，其多药耐药菌株的克隆传播己引起高度重视。为了解鲍曼不动杆菌分子流行病学相关信息，对122株临床分离株的基因同源性、耐药性和β内酰胺酶相关基因进行了检测，并研究了该菌中SHV基因的单核苷酸多态性(SNP)和VEB-3型超广谱β内酰胺酶的生化特性，以期望对预防和控制该菌耐药性的传播及指导临床合理用药提供理论依据。 (D鲍曼不动杆菌耐药性与β内酰胺酶基因型研究 本文采用K-B纸片法进行122株鲍曼不动杆菌临床分离株的药敏检测，并通过特异性的聚合酶链反应和DNA序列测定的方法测定了这些菌株中的β内酰胺酶相关基因分布。结果表明该菌除对亚胺培南和美罗培南的敏感率分别高达100％和88。5％，对含酶抑制剂的氨苄西林／舒巴坦和头孢哌酮／舒巴坦敏感率分别为52．5％和57。4％外，而对其他抗生素的敏感率均很低，对头孢三、四代药物的敏感率均不到20％。122株鲍曼不动杆菌中，76株(占62．3％)扩增到B内酰胺酶基因，SHV、TEM、PER、CTX-M-1组、CTX-M-9组和VEB基因的检出率分别为19．7％、47．5％、13．9％、1．6％、4．1％和0．8％，未检测到CTX-M-2组、OXA-lO和HOXA-23基因。其中42．6％含单种基因；14．8％含两种基因，主要为SHV+TEM基因(10株)，其次为TEM+CTX-M-9基因(3株)和TEM+PER基因(3株)；4．9％含三种基因，主要为SHV+TEM+PER基因。此外，序列测定结果显示各基因型分别为：SHV-lb-Like、SHV-18-Like、TEM-1-Like、PER-1-Like、CTX-M-3-Like、CTX-M-14-Like、VEB-3-Like。其中SHV-1b基因序列为我们首次报道，其核苷酸序列与SHV-1的编码基因(X98098)相比仅一个位点发生改变，即357位的C突变为T，但其对应氨基酸未发生改变。该序列已在GenBank登录(AY787643)。通过对鲍曼不动杆菌耐药性的研究，有助于了解其耐药性的特点和变化以指导临床用药。同时对B内酰胺酶基因型进行研究，则有助于发现新的基因并进一步研究基因的定位或传播方式及其编码的β-内酰胺酶的生化特性。 (2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测鲍曼不动杆菌中SHV基因SNP 在超广谱β内酰胺酶(ESBL)中SNP的现象非常普遍，为获得鲍曼不动杆菌中SHV基因SNP的资料，采用变性梯度凝胶电泳并结合DNA序列测定，检测了24株SHV基因阳性的鲍曼不动杆菌SHV基因SNP。对这些菌株SHV基因的PCR产物直接进行DGGE电泳的结果显示，24例标本均呈现出单一条带，但条带的位置明显不同，可分为A、B两组；对两组标本分别用含GC后夹的引物进行SHV基因PCR扩增后再行DGGE，结果显示各产物均为单一条带，而且每组条带均处于同一位置。测序结果表明两组产物分别为SHV-1b-Like、SHV-18-Like，说明目前我院鲍曼不动杆菌中SHV基因仅存在两种型别，少于在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中流行的SHV基因型别种类。通过DGGE，不仅能较为简便和迅速地获得某种基因的SNP资料，而且有利于高效和经济地筛选出新的核苷酸突变。 (3)VEB-3型超广谱β-内酰胺酶生化特性的研究 VEB-3型ESBL首次在我院的阴沟肠杆菌临床分离株中发现。前期的研究中，我们又首次在鲍曼不动杆菌临床分离株ABl30中检测到VEB-3基因。为了解其生化特性，并与VEB-1型ESBL进行比较，我们将VEB-3和VEB-l基因连接至pET28a载体上，并用重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达，分别挑选blavEB-3或blavEn-1阳性表达的菌落测定β一内酰胺类抗生素对其最低抑菌浓度(MIC)，同时提取酶蛋白进行等电点和酶动力学分析。结果显示，VEB～3和VEB-l型ESBL具有基本一致MIC和相同的等电点(pI7．45)，但两者的酶动力学性质存在一定的差异：对头孢他啶和头孢噻肟，VEB-3较VEB-1表现出更高的亲和力，两者Km相差一倍左右；对头孢噻吩，VEB-1比VEB-3更具亲和力；而对阿莫西林，VEB-1型ESBL表现出很高的亲和力，而VEB-3仅有低的亲和力，两者Km值相差20多倍。VEB-3和VEB-1型ESBL具有相同的等电点，不同的动力学参数，bIavEB-i基因中Leu56→Phe突变可能导致了两者酶动力学性质的差异。 (4)鲍曼不动杆菌基因同源性研究 临床分离菌株的基因同源性分析对于流行病学调查，特别是传染源和传播途径的追踪具有重要意义。为了解我院鲍曼不动杆菌的基因同源性，我们采用重复序列PCR技术(rep-PCR)对前期研究中获得的122株细菌基因组DNA进行了分型，分别以REP(Repetniveextragenicpalindromic，基因外重复回文序列)、ERIC(Enterobacterialrepetniveintergenicconsensussequence，肠杆菌基因间重复一致序列)引物进行PCR扩增。结果显示，REP-PCR将鲍曼不动杆菌分为14种基因型(A～N)，其中H型含98株，为主要的流行型别，并可分为6个亚型；ERIC-PCR将菌株分为13种基因型(A’～M’)，其中L’型100株，为主要的流行型别，并可分为5个亚型。其余菌株在其他基因型中均为零星分布。H型和L’型菌株对头孢他啶和头孢噻肟两种抗生素中至少有一种为耐药。以上结果提示，在鲍曼不动杆菌基因同源性分析中，REP-PCR的分辨率较ERIC-PCR高；同时表明我院存在着某一基因型鲍曼不动杆菌的感染流行，估计该型菌株可能以克隆株的形式播散。