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病毒感染是造成家蚕死亡的主要原因,对养蚕业造成的损失约占全部蚕病损失的70％左右,其中,家蚕质型多角体病毒是引起家蚕病毒病的重要病原体之一。昆虫的抗病毒机制研究仍处于起始阶段,对家蚕中利用细胞凋亡进行抗病毒以及由此产生的免疫抑制机制还不是很清楚。本论文采用RACE、RT-PCR和基因原核重组表达等分子生物学技术开展了对家蚕神经节苷酯诱导分化相关蛋白1(BmGDAP1)、胰岛素相关肽结合蛋白(BmIBP2)、含有LIM和SH3结构域的蛋白(BmLASP1)、泛素蛋白连接酶E3样Synoviolin(BmSYVN)、肽聚糖识别蛋白(BmPGRP)、芳香贮存蛋白(BmAryl)、泛素羧基端水解酶46(BmUSP46)、依赖ATP的RNA解旋酶DDX54(BmDDX54)等基因进行了克隆、表达和功能研究。 BmGDAP1、BmIBP2、BmLASP1、BmSYVN基因是与家蚕细胞凋亡相关的一些基因,它们的cDNA全长分别为1514、1179、2094、和1739 bp,开放阅读框编码的蛋白分别含有332、260、455和450个氨基酸残基。这些蛋白均含有保守的结构域,并分别具有各蛋白家族保守的序列特征。BmGDAP1中包含一个thioredoxin(TRX)、一个glutathione S-transferase-C(GST-C)和一个C端的穿膜结构域;BmIBP2包含一个信号肽、IG和IGc2结构域;BmLASP1包含一个LIM、两个nbulin和一个SH3结构域;BmSYVN包含一个HRD1结构域。 对BmGDAP1、BmIBP2、BmLASP1、BmSYVN的mRNA的组织表达特异性和对感染BmCPV的响应进行了研究,发现在健康的五龄第3天的家蚕中,BmIBP2仅在中肠中表达,而其它基因在各个检测组织中均有表达。BmGDAP1在血淋巴和中肠的表达量较高, BmLASP1在精巢、卵巢、血淋巴和气管中表达量较高,其中性腺中的表达量最高。对家蚕个体进行病毒接种后可显著诱导BmIBP2在中肠中的表达,BmGDAP1和BmSYVN在中肠中的表达量也被上调;而中肠中的BmLASP1的表达被抑制,其表达量下调。推测这些分子可能参与了家蚕对病毒感染诱导细胞凋亡的免疫防御调节。 家蚕感染BmCPV后其他一些差异表达的基因-BmPGRP、BmAryl、BmUSP46、BmDDX54,它们的cDNA全长分别为807、2260、1440、和1954 bp,开放阅读框编码的蛋白分别含有200、696、392和605个氨基酸残基,且这些蛋白均含有保守的结构域,并分别具有各蛋白家族保守的序列特征。BmPGRP中包含一个信号肽和PGRP结构域;BmAryl包含一个信号肽、一个Hemocyanin-N、Hemocyanin-M和Hemocyanin-C结构域;BmUSP46包含一个peptidase-C19结构域;BmDDX54包含一个DEADc、HELICc和DBP10C结构域。 对BmPGRP、BmAryl、BmUSP46、BmDDX54的mRNA的组织表达特异性和对感染BmCPV的响应进行了研究。发现在健康的五龄第三天的家蚕中,这些基因在各个检测组织中均有表达,除了BmAryl在脂肪体和血淋巴的表达量很高,其他基因在各个组织中的表达量差别不大。对家蚕个体进行病毒接种后可显著抑制BmAryl在中肠中的表达, BmUSP46略有下调,而BmPGRP和BmDDX54在中肠中的表达量上调。推测这些分子可能通过不同的途径参与家蚕对病毒感染的免疫防御调节。 通过构建原核表达载体对BmIBP2和BmPGRP的成熟肽进行体外重组表达,纯化并得到了该重组表达蛋白,western检测证明了重组表达的正确性。通过制备多克隆抗体,检测到BmIBP2蛋白主要在家蚕中肠中表达,与其mRNA的表达特异性是一致的,推测BmIBP2通过自分泌或旁分泌起作用。 除了在基因的mRNA水平上,我们还在蛋白水平上检测了家蚕感染BmCPV后表达差异的蛋白。通过蛋白质双向电泳对感染蚕和对照组的中肠组织蛋白进行了比较分析,找到了8个差异蛋白点,进一步利用质谱技术对这些差异点进行鉴定,其中在感染蚕中肠上调表达的蛋白点有5个,经质谱鉴定分别为Ras-鸟嘌呤核苷酸释放因子1 (RASGRF1)、H+转运ATP合成酶亚基、异戊烯磷酸合酶亚基2(PDSS2)、多药耐药蛋白(MRP4/ABCC4)和冻坏B样蛋白(NIPBL);在对照蚕中出现的蛋白点,而在感染蚕下调的有3个,经质谱鉴定分别为类固醇脱氢酶、线粒体的电压依赖的阴离子通道孔蛋白和一个未知蛋白。 本研究结果表明,差异基因BmGDAP1、BmIBP2、BmLASP1、BmSYVN和差异蛋白线粒体的电压依赖的阴离子通道孔蛋白、RASGRF1、PDSS2、MRP4作为家蚕中调节细胞凋亡的重要因子可能参与了家蚕对BmCPV感染诱导细胞凋亡的响应。该研究结果将为进一步揭示家蚕中存在细胞凋亡的抗病毒机制提供分子生物学证据,同时也为深入了解家蚕的免疫防御机制,丰富和发展无脊椎动物免疫学内容提供了理论基础。