1.研究背景与目的： 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方、东南亚以及南非的一些地区常见的一种恶性肿瘤，因为其独特的流行病学、病理学、临床表现、治疗和预后以及与EB病毒(Epstein—BarrVirus)紧密相关等特征而有别于其他的头颈癌。目前，虽然鼻咽癌的病因学机制还未被完全阐明，但是其发病率的地理分布特征提示了该疾病的发生可能是环境和遗传因素相互作用的结果，其发生发展可能涉及到基因易感性、环境危险因素、特定饮食习惯和EB病毒(Epstein—BarrVirus，EBV)感染及突变等因素。EB病毒(Epstein—BarrVirus，EBV)是一种含173kbDNA基因组的人类γ—疱疹病毒，EB病毒的感染在世界范围内十分普遍，90％以上的个体被EB病毒感染，但并不引起症状，而是潜伏于宿主外周血B淋巴细胞中并可持续终生。 EB病毒编码的核抗原1(EBNA1)是唯一的在所有增值感染细胞中持续表达的蛋白；以同二聚体的形式直接结合到EB病毒DNA潜伏复制起始区(oriP)内的特异性识别位点上，在EB病毒潜伏感染中起多种重要作用，包括：启动EB病毒DNA的复制、EB病毒基因组的有丝分裂、其他EB病毒潜伏蛋白的转录激活等。EB病毒DNA的复制开始于含有4个EBNA1结合位点的oriP的二重对称原件(DS)内。EB病毒附加体的分离需要EBNA1结合到oriP内含有20个EBNA1结合位点的重复序列家族(FR)元件上。FR还足EBNA1激活的潜伏膜蛋白启动子和Q启动子的增强子。EBNA1蛋白也自动调节Ⅰ型潜伏感染时启动EBNA1表达的Qp启动子。EBNA1蛋白有641个氨基酸残基组成，能够被分成N—末端(1-89氨基酸残基)和C—末端(328-641氨基酸残基)结构域，中间的甘氨酸—丙氨酸残基短链重复序列(GAR)将两末端结构隔开。EBNA1蛋白上介导与DNA结合和形成二聚体的残基定位在C—末端的459-607为氨基酸残基之间；1-89位和322-379位氨基酸残摹互相协调共同介导病毒基因组以附加体的形式连接细胞染色体上并持续存在和激活转录的基本机构，然而，379-386位氨基酸残基是核定位序列，605-641位氨基酸残基的肽段存在一个酸性激活的结构域。根据EBNA1蛋白第487位氨基酸的变异，将其分为五种亚型，其中两种为原型(prototype，p—)，三种为变异型(variant，v—)，即P—ala，P—thr，V—val，V—leu和V—pro。有报道称V—val型EBNA1与鼻咽癌的感染密切相关，在20例中国人鼻咽癌活检标本中检测到的EBNA1全部是V—va型。我们先前的研究发现96.55％(84/87)鼻咽癌标本有只含单一的V—val型EBNA1基因；然而，通过对EB病毒健康携带者外周血单个核细胞DNA的检测发现在健康人外周血中77.08％(111/144)是V—val型、P—ala型和(或者)V—thr型EBNA1的混合型。因此我们有理由推测V—val型EBNA1在鼻咽癌的发生发展中比其它亚型EBNA1更有优势。我们分析比较了V—val型和原型EBNA1测序结果发现，绝大部分V—val型EBNA1的突变都导致了重要功能区内的实际氨基酸残基的改变，这很可能导致V—val型EBNA1在生物学功能上与原型明显不同。我们课题组先前的研究证明V—val突变型EBNA1蛋白与原型EBNA1蛋白之间在功能学上有重要差异：我是通过将V—val突变型和P—ala原型EBNA1基因分别克隆至pGFP—C2载体上并在293细胞中表达，结果发现含V—val型EBNA1蛋白具有更强的转录活性和维持宿主细胞存活的能力。 EBNA1的表达在Ⅰ型和Ⅱ型潜伏中则由Q启动子(Qp)启动，因此鼻咽癌中的EBNA1蛋白的表达由Qp启动子启动。与细胞管家基因的启动子相似，Qp的TATA序列含量少，主要靠富含CpG序列的启动元件发挥作用，其活性受普遍存在的细胞转录因子Sp1的调控，Qp的CpG岛通过与不受甲基化影响的细胞因子(如Sp1等)结合来使自身处于未甲基化状态。CpG序列在EB病毒基因表达调控中起非常重要的作用，甲基化状态是其表达调控的机制之一。 本课题为了进一步确定V—val突变型EBNA1蛋白在功能上的优势以及导致这种优势的相关变化的区域；我们构建了一批EBNA1的表达克隆，包括：pp—EBNA1(N端和C端均未突变)、pv—EBNA1(N端未突变C端突变)、vp—EBNA1(N端突变C端未突变)和vv—EBNA1(N端和C端均突变)，此外我们还构建了含FR序列的报告质粒：采用Westernblotassay、Reporterassays和Electrophoreticmobilityshiftassay等方法探测不同突变型EBNA1蛋白同FR的亲和力和转录活性强弱。 另外，鼻咽癌中EB病毒潜伏感染时的EBNA1蛋白表达是由Qp启动，因此我们研究了突变型Qp与鼻咽癌的相关性。我们从鼻咽癌组织与健康人外周血标本的DNA中用PCR方法分别扩增出Qp序列并测序，结果发现与B95.8原型相比，鼻咽癌中Qp启动子有两个位点常常发生点突变，即：62225位点g→a突变，62422位点g→c突变，而且在病例与健康人标本中的突变率有差异。通过荧光素酶报告基因活性检测和染色质免疫共沉淀实验，我们探讨了Qp启动子突变的功能学意义。 2.研究方法： 构建了各种亚型EBNA1的表达质粒和含FR的荧光素酶报告质粒，转染HaCat、CNE—2和293细胞；采用Westernblot证实EBNA1的在上皮细胞内表达、荧光素酶活性实验研究各亚型EBNA1对质粒的转录激活能力和凝胶迁变实验探讨V—valEBNA1与原型EBNA1同FR的结合力强弱。 采用PCR的方法扩增鼻咽癌石蜡标本和健康成人外周血标本中的Qp片段并测序分析突变与鼻咽癌的相关性，构建各亚型Qp的荧光素酶报告质粒来探讨启动转录的活性，采用染色质免疫共沉淀实验探讨突变型与原型Qp与Sp1的结合力。 3.研究结果： Westernblot证实了EBNA1的表达载体在上皮细胞内有效表达；V—valEBNA1比pp—EBNA1的转录活性增强，且主要是靠EBNA1蛋白的C—末端突变；vv—EBNA1与FR结合力比pp—EBNA1的更强。 通过PCR扩增和测序实验，证实Qp的突变与鼻咽癌有密切的相关性。突变型Qp启动转录的活性明显高于原型，并且突变型Qp与Sp1的结合能力比原型Qp明显增强。 4.结论： 鼻咽癌中V—val型EBNA1可能是通过增强与FR结合力，使得EBNA1的转录活性显著增强，并且这种突变可能主要是C—末端的突变引起；V—val型EBNA1可能对于维持EB病毒的潜伏感染以及鼻咽癌的发生发展有重要作用。突变型Qp可能通过增强与Spl结合力，使其启动转录的活性明显增强，Qp特定位点的突变在EB病毒对鼻咽上皮细胞的感染和转化过程中可能也起了重要的作用。