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糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定化修饰是一种保守于真核生物中的蛋白质翻译后修饰方式。在哺乳动物细胞中有超过150种细胞膜蛋白都被GPI锚修饰。GPI在内质网中合成并与蛋白质结合,之后从内质网经由高尔基体转运到细胞膜表面。在GPI的合成过程中,一条酰基链会被加到GPI前体的肌醇环2号位置。当蛋白质转移到GPI上时,这条酰基链会被GPI肌醇脱酰酶(PGAP1)切除。该反应影响GPI锚定蛋白从内质网向高尔基体的转运效率,同时还影响GPI在内质网和高尔基体中的结构重组。成熟的GPI锚定蛋白可以被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)从细胞膜表面切割下来,而肌醇酰基化的GPI锚定蛋白不能够被PI-PLC切割,对PI-PLC处理呈现出抗性。本论文利用PI-PLC可以特异性切割GPI锚定蛋白的特点,在哺乳动物单倍体细胞中利用基因诱捕技术筛选调控GPI肌醇脱酰基反应的调控因子。经测序分析发现了8个参与GPI肌醇脱酰基过程的基因,其中包括编码GPI肌醇脱酰酶的基因PGAP1。大多数糖蛋白都在内质网中合成和解聚,很多分子伴侣参与了蛋白质的折叠。在蛋白质从内质网转运出去之前,需要经过内质网质量控制系统以确保蛋白质折叠完全。天冬酰胺(N)连接的糖基化修饰作为蛋白质翻译后修饰的另外一种重要方式,在新生糖蛋白的质量控制中发挥着关键作用。本研究通过对筛选到的MOGS,GANAB和CANX基因进行分析,发现GPI锚定蛋白上的N-糖基化修饰参与调控了GPI锚定蛋白的质量控制和GPI的结构重组,干扰钙连蛋白循环降低了GPI肌醇脱酰基反应的效率。主要研究结果总结如下:(1)本研究通过基因诱捕技术在人的单倍体细胞HAP1中筛选到除PGAP1之外7个对PI-PLC处理具有抗性的基因,包括SELT,CANX,C18orf32,CLPTM1,MOGS,SEC63和GANAB。利用CRISPR-Cas9系统在HEK293细胞中敲除PGAP1和这7个基因,与单倍体细胞筛选结果相符,PGAP1敲除细胞对PI-PLC处理完全具有抗性,其它7个基因的敲除细胞对PI-PLC处理具有部分抗性。过表达相关基因或PGAP1可以回补PI-PLC抗性的性状,说明这7个基因确实参与调控了PGAP1介导的GPI肌醇脱酰基反应。这7个基因敲除的细胞中PGAP1的的表达量,定位及蛋白质的稳定性没有发生变化。(2)在筛选到的7个基因中,有3个基因参与了蛋白质上N-糖链的加工和识别。其中MOGS和GANAB编码的α-葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ负责切除糖链末端的葡萄糖残基,CANX编码的钙连蛋白参与蛋白质质量控制。用葡萄糖苷酶抑制剂DNJ处理细胞,导致细胞中GPI锚定蛋白对PI-PLC的抗性增加,这与敲除MOGS和GANAB的性状一致;敲除葡萄糖基转移酶基因ALG6和ALG8回补了MOGS基因敲除的性状;说明蛋白质N-糖链上的葡萄糖基团影响GPI肌醇脱酰基的反应效率。钙连蛋白拥有一个凝集素结构域,钙连蛋白凝集素识别位点的突变(Y164A和E216A)不能回补CANX基因敲除导致的PI-PLC抗性,说明钙连蛋白通过识别蛋白质上的糖链参与调控了GPI肌醇脱酰基反应的过程。(3)敲除MOGS基因会导致内质网压力的产生。为了证明内质网压力与GPI肌醇脱酰基反应之间的关系,用内质网压力诱导剂毒胡萝卜素和衣霉素分别处理细胞,10天后细胞中的GPI锚定蛋白对PI-PLC处理的抗性增加。同时在细胞中敲除内质网钙离子通道蛋白基因SERCA2和糖基转移酶复合物OST催化亚基STT3A和STT3B,与内质网压力诱导剂处理结果一致,基因敲除的细胞中GPI锚定蛋白对PI-PLC的抗性增加。(4)通过在细胞中过量表达错误折叠的GPI锚定蛋白时,错误折叠的GPI锚定蛋白滞留在内质网中,导致内质网压力升高,细胞内源的GPI锚定蛋白的肌醇脱酰基效率下降,而在敲除CANX基因的细胞中则没有变化。当表达不含糖链的错误折叠GPI锚定蛋白或其它错误折叠膜蛋白时,细胞中GPI锚定蛋白的肌醇脱酰基效率没有改变,说明GPI锚定蛋白的质量控制和加工过程同时依赖于N-糖链和GPI锚。免疫共沉淀和免疫印迹结果显示钙连蛋白同时与GPI锚定蛋白和PGAP1相互作用,提高了PGAP1催化的GPI肌醇脱酰基反应效率。