本文主要从以下几个方面进行论述：　　第一部分 DSTD对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和M I F表达水平的影响　　目的：　　探讨DSTD对骨肉瘤细胞MG-63和U2OS增殖、凋亡的影响及MIF表达水平的影响。　　方法：　　1.用含10％小牛血清(FBS)的DMEM培养基培养MG-63和U2OS细胞，置于37℃、5％CO2培养箱内常规传代培养。　　2.用MTT实验和LDH释放实验检测不同浓度DSTD(0、1uM、10uM、50uM、100uM)分别处理细胞24h后，统计DSTD对细胞增殖和凋亡的影响及浓度依赖性。　　3.100uM DSTD作用于MG-63和U2OS细胞24h后，用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞内MIF mRNA的含量的变化，用Western Blot法检测细胞内MIF蛋白表达情况。　　结果：　　1.DSTD能抑制MG-63和U2OS细胞的生长，且呈一定浓度依赖性，但与对照组相比，差异无显著统计学意义。100uM DSTD作用于MG-63和U2OS细胞24小时没有明显改变细胞的增殖活力和细胞的凋亡率。　　2.Real-time PCR结果:100uM DSTD处理MG-63和U2OS细胞24h后可显著降低MIF mRNA的转录水平。　　3.Western Blot结果:100uM DSTD处理MG-63和U2OS细胞24h后，MIF蛋白表达水平明显降低。　　结论：　　DSTD没有明显影响人骨肉瘤细胞MG-63和U2OS的增殖活性和凋亡水平，但明显减少了人骨肉瘤细胞MG-63和U2OS的MIF表达水平。　　第二部分 DSTD通过抑制MIF的表达诱导骨肉瘤细胞ROS介导的自噬的研究　　目的：　　通过研究DSTD作用于骨肉瘤细胞MG-63和U2OS后检测MIF和自噬相关蛋白的表达，探讨DSTD诱导骨肉瘤自噬发生中的作用及分子机制。　　方法：　　1.体外培养MG-63和U2OS细胞株，取对数生长期的细胞进行实验研究。　　2.100uM DSTD处理骨肉瘤细胞MG-63和U2OS24h后和MIF ShRNA处理细胞48h后，分离细胞核和细胞质蛋白，用Western Blot检测MIF、Bcl-2、Bax、pERK、Cyto HMGB1、Nucleic HMGB1蛋白的表达水平。　　3.100uM浓度的DSTD作用于MG-63细胞和U2OS细胞不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、48h)后用Westren Blot检测自噬相关基因LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平。　　4.不同浓度DSTD(0uM，50uM、100uM)作用于骨肉瘤细胞U2OS和MG-6324h后用Western Blot检测MIF、Bcl-2、Bax、pERK、HMGB1、LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平。　　5.用100uM DSTD与15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U2OS细胞不同时间后，分离细胞核和细胞质蛋白，用Western Blot检测MIF、Bcl-2、Bax、pERK、PARP、c-PARP、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Histone H3、Cyto HMGB1、NucleicHMGB1蛋白的表达水平。　　6.MTT实验和LDH释放实验:用100uM DSTD与15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U2OS细胞不同时间后，MTT法测定细胞增殖抑制率，LDH释放实验测定细胞毒性。　　7.AnnexinⅤ/PI(AnnexinⅤ-FITC)双染法流式细胞术测定细胞凋亡率:选用100uM DSTD或15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U2OS细胞不同时间后，用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行检测分析凋亡。　　8.DCF-DA法测定活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS):选用100uM DSTD或15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U2OS细胞不同时间后，ROS的产生用氧化反应敏感的荧光试剂DCF-DA检测。　　9.免疫荧光:选用100uM DSTD或15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U2OS细胞不同时间后，细胞用含4％多聚甲醛的PBS溶液固定30分钟，再用含0.2％ Triton x-100的PBS渗透15分钟。随后细胞用10％的正常山羊血清封闭非特异性结合位点，室温放置1小时。　　结果：　　1.100uM DSTD和MIF shRNA均显著地抑制了MIF的表达，同时导致了Bcl-2的明显减少和Bax的明显增加（Bax/Bcl-2比值上调），抑制了ERK的磷酸化。胞核HMGB1的含量减少，而胞浆HMGB1含量增加。　　2.当用100uM DSTD作用于骨肉瘤细胞株24小时后，LC3B-Ⅰ明显地发生了向LC3B-Ⅱ的转化。LC3B-Ⅱ富集的量与DSTD作用时间呈正相关，这提示DSTD诱导的自噬呈现时间依赖性。　　3.分别用不同浓度DSTD处理U2OS和MG-63细胞24h后，免疫蛋白印迹表明，随着DSTD浓度的增加，U2OS和MG-63细胞中MIF、Bcl-2、pERK、HMGB1的表达逐渐降低，而Bax的表达逐渐增加。随着DSTD浓度的增加LC3B-Ⅱ富集量也逐渐增加。这提示DSTD诱导的自噬呈现浓度依赖性。　　4.我们检测了抗氧化剂NAC对DSTD诱导的信号传导的作用。Wetern blot结果显示，NAC共刺激逆转了DSTD诱导的信号传导途径，但DSTD诱导的PARP的富集和PARP的剪切激活（c-PARP的形成）不能被NAC共刺激逆转。　　5.MTT结果显示抗氧化剂NAC共刺激后细胞增殖明显降低，LDH释放实验显示NAC共刺激后细胞毒性增加。　　6.流式细胞术结果显示，NAC共刺激促进了细胞凋亡。　　7.荧光素乙二脂染色法(DCF-DA)来追踪人骨肉瘤细胞株中ROS的产生。实验发现，ROS的产生量随着DSTD作用时间的增加而增高，但却能被NAC抑制。　　8.免疫荧光检测DSTD诱导的自噬，结果显示LC3的形成很明显，且呈时间依赖性。NAC共刺激减轻了DSTD诱导的自噬。　　9.3-MA能够减少DSTD诱导人骨肉瘤细胞U2OS和MG-63产生的LC3B-Ⅱ表达水平。3-MA引起的自噬抑制作用也抑制了细胞增殖，并且促进了细胞凋亡，这提示我们DSTD诱导的自噬确实能延缓细胞死亡。　　结论：　　DSTD可通过抑制MIF诱导U2OS和MG-63细胞发生自噬，且呈现时间和剂量依赖性。DSTD诱导的自噬是ROS介导的，并且自噬延缓了细胞死亡。　　第三部分 DSTD对骨肉瘤细胞耐药性的影响及机制　　目的：　　探讨DSTD在骨肉瘤细胞化疗药物耐药中的作用及其分子机制。　　方法：　　1.体外培养MG-63和U2OS细胞株，取对数生长期的细胞进行实验研究。　　2.用0.5uM的阿霉素或50uM的顺铂在100uM的DSTD存在或不存在的情况下处理24h后在显微镜下观察人骨肉瘤细胞U2OS和MG-63形态的改变。　　3.MTT实验检测不同浓度化疗药物阿霉素或顺铂单独及联合DSTD对人骨肉瘤细胞增殖活性的影响。　　4.细胞用0.5uM的Dox或50uM的Cis在100uM的DSTD存在或不存在的情况下共刺激MG-63和U2OS细胞24h。　　5.MG-63和U2OS细胞转染GV230-HMGB1质粒DNA72h后，WesternBlot检测HMGB1过表达对HMGB1、pERK、LC3和PARP蛋白表达的影响，LDH释放实验检测HMGB1过表达对细胞凋亡的影响。　　结果：　　1.与对照组比较，DSTD导致细胞轻微的皱缩，而阿霉素和顺铂部分导致细胞皱缩。在DSTD和化疗药物阿霉素或顺铂一起联合作用于人骨肉瘤细胞的时候，引起了大批的细胞死亡。　　2.化疗药物阿霉素和顺铂以剂量依赖的方式减少了细胞增殖。DSTD与化疗药物阿霉素或顺铂联合使用比化疗药物单独使用导致细胞增殖减少更为明显，DSTD一同作用提高了骨肉瘤细胞对阿霉素和顺铂的敏感性。　　3.Western blot结果显示100uM的DSTD逆转了Dox和Cis诱导的HMGB1蛋白表达水平升高。Real-time PCR结果显示100uM的DSTD也减少了Dox和Cis诱导的HMGB1 mRNA转录水平升高。　　4.Western Blot检测结果提示:在化疗时，HMGB1的过表达阻断了DSTD诱导的信号转导。　　5.LDH释放实验结果显示:在化疗时，HMGB1的过表达阻断了DSTD诱导的细胞死亡。　　结论：　　HMGB1过表达诱导的自噬拯救了细胞死亡，而DSTD抑制MIF通过下调HMGB1的表达促进了细胞死亡，减轻了人骨肉瘤细胞对化疗药物的耐药性。