【摘 要】
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miRNAs在卵巢中表达十分丰富,并在调控卵巢功能中发挥重要作用,目前很多研究报道,mi R-148a-3p在疾病与调控细胞增殖凋亡上发挥着重要作用,但其对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究鲜有报道。基于此,本试验采用大足黑山羊的卵巢颗粒细胞作为试验对象,利用过表达或抑制miRNA-148a-3p、q RT-PCR、Western Blot、流式细胞术、ELISA等技术与方法,探究了miRNA-148
【基金项目】
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重庆市技术创新与应用发展专项重点项目（cstc2021jscx-gksb0008）；
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miRNAs在卵巢中表达十分丰富,并在调控卵巢功能中发挥重要作用,目前很多研究报道,mi R-148a-3p在疾病与调控细胞增殖凋亡上发挥着重要作用,但其对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究鲜有报道。基于此,本试验采用大足黑山羊的卵巢颗粒细胞作为试验对象,利用过表达或抑制miRNA-148a-3p、q RT-PCR、Western Blot、流式细胞术、ELISA等技术与方法,探究了miRNA-148a-3p对颗粒细胞功能的影响,为进一步了解mi R-148a-3p调控卵泡生长发育的机制打下基础。本试验的结果如下:1.过表达或抑制miRNA-148a-3p后,利用CCK8检测转染不同时间后的山羊卵巢颗粒细胞增殖活力,结果显示,过表达组在转染72 h时细胞增殖活力极显著高于对照组（P＜0.01）,转染72 h时抑制组的细胞增殖活力也显著低于对照组（P＜0.05）;Ed U检测结果显示,过表达组中的Ed U阳性细胞的比例极显著高于对照组（P＜0.01）。进一步利用q RT-PCR检测,发现miRNA-148a-3p过表达组中PCNA的m RNA和蛋白相对表达量较对照组极显著上升（P＜0.01）,而抑制组中PCNA的m RNA和蛋白相对表达量较对照组显著下降（P＜0.05）。利用流式细胞术检测过表达或抑制mi R-148a-3p后细胞周期的变化,发现过表达mi R-148a-3p显著上调CCND1的m RNA表达（P＜0.05）,极显著下调G1期细胞的比率并极显著上调G2期细胞的比率（P＜0.01）。结果表明miRNA-148a-3p促进颗粒细胞增殖2.利用流式细胞术检测过表达或抑制miRNA-148a-3p后颗粒细胞的凋亡情况,结果显示,miRNA-148a-3p过表达组的凋亡率极显著低于对照组（P＜0.01）,同时miRNA-148a-3p抑制组的凋亡率与对照组相比显著升高（P＜0.05）,说明过表达miRNA-148a-3p降低颗粒细胞凋亡率。进一步检测发现,miRNA-148a-3p过表达组中BCL2/BAX比值极显著高于对照组（P＜0.01）,miRNA-148a-3p抑制组中BCL2/BAX比值与对照组无明显差异（P＞0.05）,结果表明,mi R-148a-3p抑制卵巢颗粒细胞凋亡。3.过表达或抑制miRNA-148a-3p 24 h后,转染腺病毒检测颗粒细胞自噬情况,结果显示,过表达miRNA-148a-3p显著促进颗粒细胞自噬,而抑制miRNA-148a-3p无明显变化;进一步通过Western-blot检测,结果显示过表达mi R-148a-3p显著上调LC3-II/LC3-I比值（P＜0.05）对p62的表达无明显影响（P＞0.05）,抑制mi R-148a-3p则显著上调p62的表达（P＜0.05）对LC3-II/LC3-I比值无明显影响（P＞0.05）,说明过表达miRNA-148a-3p促进颗粒细胞自噬。4.通过ELISA试剂盒检测颗粒细胞转染miRNA-148a-3p 72 h后培养液中类固醇激素的水平,结果发现miRNA-148a-3p过表达组中细胞培养液的孕酮水平极显著高于NC组（P＜0.01）,但雌二醇水平无明显变化（P＞0.05）。miRNA-148a-3p抑制组中细胞培养液的孕酮水平极显著低于对照组（P＜0.01）,雌二醇水平也无明显变化（P＞0.05）。结果表明,miRNA-148a-3p促进颗粒细胞孕酮的分泌但不影响雌二醇的分泌。上述结果表明:mi R-148a-3p在卵巢颗粒细胞中促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导细胞自噬并促进孕酮的合成。研究结果为揭示mi R-148a-3p调节卵泡发育与闭锁的机制提供了理论基础。
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