斑点雀鳝肺炎克雷伯氏菌的分子鉴定及感染后宿主免疫基因的表达分析

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斑点雀鳝作为较低等的全骨鱼类,并没有经历硬骨鱼类特有的第三次全基因组复制事件。因此斑点雀鳝基因组在含量和大小上保守,与硬骨鱼相比更接近人类基因组,作为桥梁可以将硬骨鱼类和四足动物很好的连接。近年来,斑点雀鳝作为生物学模型为研究免疫基因进化提供了重要的资源。本研究偶然从实验室患病斑点雀鳝中分离出病原菌,鉴定其为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。用不同浓度的病原菌腹腔注射健康斑点雀鳝,在处理后的半个月内对斑点雀鳝的状态进行观察记录。感染8天后,斑点雀鳝出现与疑似病例相同病症,例如,肝脏、脾脏等内脏出现明显充血、肿胀现象;且在发病斑点雀鳝体内可再次分离得到肺炎克雷伯氏菌。分离菌对链霉素、庆大霉素敏感;对利福平、阿莫西林、红霉素药物有较强的耐药性。我们通过PCR对纯化菌株含有的毒力基因、耐药基因进行鉴定并利用在线软件分析菌株潜在的次级代谢产物生物合成基因簇。此外,将分离菌株感染健康的斑点雀鳝并在感染后2、4、8天采取雀鳝脾脏做组织切片,发现感染细菌后斑点雀鳝脾脏肿胀,切片显示淋巴细胞大量减少,红髓面积大量增加。基于斑点雀鳝特殊的进化地位,我们利用NCBI已上传的斑点雀鳝基因组数据获得斑点雀鳝肿瘤坏死细胞因子配体和受体基因(TNFSF14、TNFRSF1A、TNFRSF1B和TNFRSF14)的部分c DNA的预测序列,通过SMART-RACE方法扩增得到它们的全长,并通过生物信息学技术对其基因结构、氨基酸序列比对、进化关系、共线性以及3D结构进行分析。TNFSF14、TNFRSF1A、TNFRSF1B和TNFRSF14的c DNA全长分别为723、1915、1863和1383 bp,分别编码240、403、446和197个氨基酸(aa)。此外,TNFSF14、TNFRSF1A、TNFRSF1B和TNFRSF14在斑点雀鳝的肾脏、鳃、肝脏、肠、脾脏中呈组成型表达。其中,TNFRSF14基因为首次在鱼类中报道,TNFSF14基因在鱼类中仅在斑马鱼和河鲀中报道。为探究分离得到的肺炎克雷伯氏菌KPY01菌株与宿主免疫关系,我们进一步分析斑点雀鳝感染KPY01菌株后免疫相关基因表达情况。在感染斑点雀鳝2、4、8天后对其脾脏、肾脏、鳃进行取样,分析TNF配受体家族的TNFSF14、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF14,白介素家族的IL-8、IL-10、IL-12A、IL-18以及干扰素IFN-γ等免疫基因m RNA表达情况。研究发现,感染后的斑点雀鳝脾脏、鳃和肾脏等免疫组织IL-10、IL-12A、IL-18以及干扰素IFN-γ等细胞因子的表达显著上调,表明这些免疫基因在宿主抵御细菌感染的免疫防御反应中发挥重要作用。本试验偶然从低等全骨鱼类斑点雀鳝中分离出肺炎克雷伯氏菌,并对其发病症状以及菌株的毒力、耐药性质和潜在的次级代谢产物生物合成基因簇进行了分析和预测。分离菌株感染斑点雀鳝后做病理切片及探究感染后宿主免疫基因表达情况,以期为鱼类肺炎克雷伯氏菌诱发疾病的有效检验、预防及鱼类应答肺炎克雷伯氏菌感染的免疫应答机理提供依据和参考。
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