背景冬凌草甲素属于四环二萜类化合物,来自唇形科香茶菜属植物,我国是该属植物资源最丰富国家。冬凌草甲素具有清热解毒、消炎止痛及抗肿瘤等作用,市场上又有各种各样的冬凌草茶用于保健,其作用机理尚待研究证实。深入研究其在细胞内促凋亡、抗炎、抗氧化信号通路作用机制十分必要。我们选择了同时与抗氧化、炎症和肿瘤密切相关的Nrf2-Keap1信号通路,检测冬凌草甲素对此信号通路的作用。肝脏是人体的解毒器官,各种有害物质如酒精都是通过肝脏代谢,会对肝细胞造成一定程度的损伤,目前认为氧化损伤是其中重要的机制。而Nrf2是细胞降低活性氧,抵御外来有害刺激的重要转录因子。正常状态下Nrf2与其分子伴侣Keap1结合于胞浆中,处于功能抑制状态,并由Keap1将其带入泛素化途径进行降解,因此在细胞中的半衰期很短。在细胞受到刺激时,Nrf2从Keap1中解离以稳定状态进入细胞核内,Nrf2上具有高度保守的碱性亮氨酸链功能域,其碱性区域能够与DNA上一段特异序列ARE即抗氧化反应元件相结合促进其下游基因的转录和表达。ARE是抗氧化蛋白和一些二相解毒酶基因上游的一段转录调控因子。因此Nrf2激活后会产生抗氧化应激、降低肿瘤的易感性、神经保护、抗动脉粥样硬化、延长寿命等作用。我们经研究发现冬凌草甲素能够启动Nrf2下游基因的转录。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出的有效成分,目前有许多有关其抗肿瘤、炎症作用的研究,但其是否能够抗氧化损伤尚不清楚。目的验证冬凌草甲素能够保护肝细胞免于氧化损伤,呈现冬凌草甲素的剂量依赖性。并且证明其抗氧化作用是通过Nrf2通路来实现的,依赖于Nrf2,从而起到保护肝脏的作用。方法构建载体pGL4.22-ARE-TATA-luciferase转染Chang’s Liver细胞,加入冬凌草甲素经荧光检测证实其的确能促进ARE荧光素酶报告基因的转录。然后通过免疫印迹及Real Time PCR法共同证明其上调了Nrf2和Nrf2下游的基因表达,再用流式细胞仪检测细胞内氧自由基水平。在以上结果都成立的基础上进行反证,即沉默细胞内Nrf2基因,再检测其对细胞的保护作用是否仍然存在。首先构建Nrf2-Knock-down载体,通过逆转录病毒感染正常肝细胞Chang’s Liver,筛选出Nrf2-Knock-down Chang’s Liver细胞系。通过免疫印迹证实此细胞系的Nrf2被沉默掉。用冬凌草甲素和酒精作用于构建成功Chang’s Liver细胞株,检测细胞内活性氧水平和培养上清中的AST水平以确定冬凌草甲素是否通过Nrf2通路保护肝脏细胞。结果冬凌草甲素能增强肝细胞内Nrf2的表达,促进其下游基因的转录,降低细胞内活性氧,减轻酒精对肝细胞的损伤。并且将Nrf2沉默后,冬凌草甲素的抗氧化损伤作用消失。说明冬凌草甲素对肝脏细胞有抗氧化损伤的保护作用,并且此作用是通过Nrf2信号通路的激活来实现的。结论冬凌草甲素是细胞内重要转录因子Nrf2的激活剂,通过激活Nrf2及其下游基因降低细胞内活性氧,减轻有害物质对肝细胞造成的氧化损伤。