支气管哮喘是一种以慢性气道炎症为主要特征的异质性气道疾病。全世界约有3.34亿人罹患哮喘,其中中国哮喘患者高达3千多万人,是哮喘死亡率最高的国家之一。传统观念认为嗜酸性粒细胞在气道中的过度聚集是哮喘的典型特征,并认为Th1/Th2免疫失衡是哮喘发生发展的主要机制。但近年来研究发现,高达50%的哮喘患者气道内主要以中性粒细胞炎症为主。而且在前期研究中,我们已基于诱导痰细胞分类计数技术,提出了中性粒细胞哮喘的概念,并证实成人哮喘的急性发作主要以中性粒细胞炎症亚型为主。此类哮喘患者普遍存在着激素抵抗性,即使给予高剂量的激素类药物,仍不能有效控制其症状。虽然他们只占哮喘总人群的5%~10%,但其治疗费用比例却高达哮喘相关医疗资源的50%左右,而且其发病机制尚未明确。大量研究发现,呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肺炎衣原体以及流感病毒等呼吸道病原体感染是导致中性粒细胞哮喘发生的重要诱因,而且呼吸道病原体感染可导致气道中中性粒细胞数量的异常增高,伴随着哮喘症状的加重以及激素抵抗性的产生。不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable haemophilus influenzae,NTHi)作为人上呼吸道正常定植的常见机会致病菌,已被证实是成人慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstruction pulmonary disease,COPD)的主要致病菌之一。我们在前期研究中也已证实,NTHi感染可导致COPD小鼠肺组织中Th17/Treg免疫应答的失衡,进而导致COPD的急性发作。同时临床研究发现,NTHi也参与了中性粒细胞哮喘的进程。NTHi可在60%的中性粒细胞哮喘患者诱导痰中被检出,而在糖皮质激素抵抗型哮喘患者中的检出率更是高达78%。但NTHi感染与中性粒细胞哮喘及激素抵抗性的形成之间是否存在关联,目前尚未定论。虽然也有动物实验聚焦于NTHi感染在哮喘发病过程中的作用,但结果却截然不同。研究表明生命早期感染NTHi加重了OVA小鼠的嗜酸性粒细胞炎症,伴随着Th2免疫应答的增高;而OVA激发前感染NTHi则促进了Th17免疫应答,加重了中性粒粒细胞炎症反应,同时导致了激素抵抗性的产生。这表明NTHi感染时期的不同会导致哮喘产生不同的炎症亚型。而哮喘发生后感染NTHi会对哮喘的发生发展产生什么影响,尚未见相关报道。MAPK信号通路在哮喘和COPD的发病进程中发挥着重要作用,已有研究表明MAPK的过度活化与COPD的激素抵抗性密切相关,但MAPK在中性粒细胞哮喘中的作用及机制尚未明确。因此,本文拟先构建OVA诱导的哮喘小鼠模型,然后气管接种NTHi,以模拟临床中性粒细胞哮喘的发病进程,阐明NTHi感染对哮喘疾病进程的影响;同时探讨MAPK信号通路在中性粒细胞哮喘发病机制中的作用,为临床治疗中性粒细胞哮喘提供新策略。目的:本论文拟探讨p38 MAPK信号通路在NTHi诱导的中性粒细胞哮喘中的作用,以及确认NTHi感染是否是中性粒细胞哮喘发生的主要诱因,为阐明中性粒细胞哮喘的发病机制,并为临床治疗激素抵抗型哮喘提供新策略。一、MAPK信号通路在NTHi呼吸道感染中的作用方法:将不同浓度的NTHi接种至小鼠支气管中以建立呼吸道感染模型。应用细菌平板培养法检测小鼠肺组织对NTHi的清除能力;肺功能仪检测NTHi感染导致的肺功能损伤情况;流式细胞术法检测小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的中性粒细胞和肺组织中Th17细胞的数量和比例;ELISA和HE染色分别检测BALF中IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子的含量和肺组织中的炎症浸润程度;免疫组化技术检测气道黏蛋白的表达水平;Western blot检测TLR2/4、MyD88、p38 MAPK、ERK1/2和JNK1等蛋白的表达水平和磷酸化水平,探讨MAPK信号通路在NTHi呼吸道感染中的作用。结果:高剂量(1×10~8 CFU/mL)的NTHi感染导致小鼠的死亡率显著增高(p<0.01),其可能与肺组织对NTHi的清除能力下降有关;NTHi呈剂量依赖性地导致小鼠肺功能下降、气道黏蛋白高分泌以及下呼吸道中性粒细胞炎症,其机制可能与Th17细胞的过度活化有关;NTHi感染可导致TLR4、MyD88的高表达并促进p38 MAPK的磷酸化水平。二、MAPK信号通路在NTHi诱导的中性粒细胞哮喘中的作用方法:制备OVA诱导的哮喘小鼠模型,在末次OVA激发24 h后气管接种NTHi(1×10~8 CFU/mL,30μL);感染NTHi 1h后,腹腔注射地塞米松(Dexamethasone,DEX,2 mg/kg)。应用小动物肺功能仪检测NTHi感染对OVA小鼠气道高反应性(airway hyper reactivity,AHR)的影响;ELISA和免疫组化法检测OVA小鼠气道中MUC5AC和MUC5B的表达水平;细胞分类计数法和流式细胞术分析小鼠BALF中炎性细胞的数量和比例;HE染色观察小鼠肺组织中的炎症水平;Western blot检测MAPK相关蛋白的表达和磷酸化水平。结果:OVA诱导的哮喘小鼠出现了AHR增高,粘液分泌失衡以及以Th2介导的嗜酸性粒细胞炎症等现象,但给予DEX治疗后,症状可显著改善;OVA激发24 h后感染NTHi,可进一步导致AHR的恶化和黏液过度分泌;NTHi感染可抑制气道Th2炎症反应,促进了Th17炎症反应;给予DEX治疗后,OVA/NTHi小鼠的症状未能得到有效改善;Western blot结果显示OVA/NTHi组小鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化水平显著增高。三、靶向抑制p38 MAPK活性对NTHi诱导的中性粒细胞哮喘的治疗作用方法:制备OVA哮喘小鼠模型,OVA激发24 h后气管接种NTHi以建立中性粒细胞哮喘模型,分别给予p38 MAPK的抑制剂SB203580单独治疗或联合SB203580+DEX治疗,观察其对中性粒细胞哮喘的疗效。小动物肺功能仪检测小鼠气道高反应性;流式细胞术和细胞分类计数法检测BALF中炎性细胞数量和比例;HE染色观察小鼠肺组织中的炎症水平;采用免疫组化技术检测MUC5AC和MUC5B的表达情况;Western blot技术检测NF-κB信号通路中相关蛋白表达水平。结果:单独给予SB203580可明显抑制哮喘小鼠的气道高反应性和MUC5AC/MUC5B的分泌紊乱,但未能有效改善NTHi感染诱导的Th17型中性粒细胞反应;联合SB203580+DEX治疗可显著抑制OVA/NTHi小鼠的气道高反应性、粘液高分泌以及Th17介导的中性粒细胞性炎症反应;此外,Western blot结果显示,联合SB203580+DEX治疗可显著抑制p65 NF-κB的蛋白表达水平及其磷酸化水平。结论:1.NTHi感染诱导的中性粒细胞炎症反应与TLR4-MyD88-p38 MAPK信号通路的活化有关。2.NTHi感染后过敏性哮喘的Th2型应答可转变为Th17型应答,随之诱导中性粒细胞哮喘的发生,p38 MAPK是影响该病发生的关键信号通路分子。3.联合p38 MAPK抑制剂和糖皮质激素可有效改善中性粒细胞哮喘的AHR、粘液高分泌和炎症反应,靶向抑制p38 MAPK可显著改善中性粒细胞哮喘的激素抵抗性。创新性:1.本研究建立了NTHi感染诱导的中性粒细胞哮喘模型,模拟了临床中性粒细胞炎症亚型哮喘的发病进程,发现NTHi感染可将过敏性哮喘的Th2型应答转变为Th17型应答,随之诱导中性粒细胞哮喘的发生。2.本研究发现联合p38 MAPK抑制剂和糖皮质激素可有效改善中性粒细胞哮喘的AHR、粘液高分泌和炎症反应,并提出p38 MAPK是治疗中性粒细胞性哮喘激素抵抗性的潜在靶点。