研究背景:自闭症(Autism)是一种较为严重的神经发育障碍性疾病,其患病率约为1:59,且呈逐年升高的趋势。自闭症患者典型的临床表现为语言表达困难、社交互动障碍、重复行为和狭隘而强烈的兴趣异常。症状的严重程度受个体发育水平的影响,从轻微到致残不等;自闭症患者往往合并其他精神症状如注意力缺陷、焦虑、抽搐、睡眠障碍及癫痫等。目前主要通过行为矫正改善症状,尚无有效的药物用于防治。自闭症病因复杂,已经证实的相关的致病基因达到数千个,包括MECP2、SHANK3、MEF2C、ELF1等,单一靶基因的异常不能与临床表型一一对应,难以成为治疗自闭症的突破点。临床资料显示:自闭症往往引起中枢神经系统中多个重要脑区的结构发育异常,包括皮层、海马、小脑等,这些结构异常是引起自闭症患者临床表现的重要病理学基础。改善这些结构的发育异常,是矫正自闭症样行为的重要策略。海马影响学习记忆和情绪调节,亦是具备神经发生(neurogenesis)潜能和高度可塑性的重要脑区。在人和哺乳动物中,海马齿回的颗粒下层(subgranular zone,SGZ)在生后及成年保留有一定数量的神经前体细胞能够持续不断地产生神经元。这些新产生的神经元具有高度的可塑性,能够整合入神经环路中影响脑的高级功能。促进海马神经发生能够增强学习记忆,对焦虑和抑郁样行为亦有明显的改善作用。在人和自闭症小鼠中证实海马神经发生异常与自闭症样行为的发生高度相关,促进海马神经发生则在一定程度上能够改善其自闭症样行为。因此以促进海马神经发生的策略有可能成为治疗自闭症样行为的新途径。雌激素受体β(ERβ)为脑内占优势分布的主要雌激素受体,在自闭症患者大脑皮层中检测到ER与芳香化酶(雌激素合成限速酶)的显著下调,提示ER下调为自闭症发生的高风险因素。动物实验研究证实内源性ERβ激活促进海马齿回的神经发生、增强海马的可塑性及改善认知功能;离体研究发现ERβ促进神经干细胞的增殖与分化。我们前期研究发现在海马的早期发育中ERβ在海马齿状回有较高的表达,但海马齿回内ERβ激活能否通过促进神经发生改善自闭症样行为有待于进一步阐明。干细胞移植广泛应用于再生医学。外源性干细胞不仅可以作为细胞来源的重要补充途径,并且通过自分泌或旁分泌作用而促进内源性神经干细胞的增殖与分化,在中枢神经系统疾病的治疗中具有广泛的应用前景。从胎盘中分离的人羊膜上皮干细胞(hAEC)具有多能分化能力,并且移植后排斥和肿瘤生成的风险低,是独特且理想的细胞来源。hAEC移植能够修复脑损伤和神经退行性疾病,而hAEC移植能否通过促进海马齿回的神经发生改善自闭症样行为,及促进海马齿回神经发生的调控机制目前仍不清楚。阐明ERβ激动剂处理和hAEC移植对自闭症样行为的改善作用,有望从促海马神经发生途径解析自闭症治疗的机制。研究方法:1.本研究首先采用ERβ激动剂Ly3201在C57/BL6(C57)和BTBR T+tf/J(BTBR)小鼠出生后2天(postnatal days 2,P2)给予腹腔注射进行预处理。在P14时检测小鼠皮层与海马内ERβ的表达,以明确Ly3201对内源性ERβ的激活;分析海马齿回BrdU与Sox2的表达,明确Ly3201对海马神经发生的调控。在2月龄时,进行三箱社交、理毛、旷场、高架等行为的检测,进一步明确生后早期Ly3201预处理对自闭症样行为的改善作用。2.将hAEC移植入BTBR小鼠(P60)的侧脑室,对照组注射等体积保存液。移植后一个月进行三箱社交、理毛、旷场、高架等行为学检测,明确hAEC对BTBR小鼠自闭样行为的治疗作用。分析海马齿回BrdU与DCX的表达,明确hAEC对BTBR小鼠海马神经发生的调控。通过Sox2和GFAP双标记细胞标识齿回神经前体细胞,结合Nestin、DCX、Sox2、BDNF、TrkB mRNA水平的检测,明确hAEC对海马齿回神经前体细胞的调控;采用Iba1标记小胶质细胞,荧光定量PCR检测IL6、IL1β、IL10、NF-kB、TNF mRNA水平明确hAEC对海马的免疫调节作用。研究结果:1.Ly3201通过促海马神经发生对自闭症模型小鼠的治疗作用(1)P14时,BTBR小鼠海马与皮层内ERβ的表达水平较C57小鼠显著降低,Ly3201显著增加BTBR小鼠和C57小鼠海马与皮层内ERβ的表达,提示Ly3201在P2时预处理可以显著激活内源性ERβ;(2)在三箱社交实验中,BTBR小鼠表现出典型的社交障碍,新生期ly3201预处理明显改善BTBR小鼠的社交障碍;在理毛和埋珠实验中,BTBR小鼠较C57小鼠理毛时间延长、埋珠数量增多,而新生期ly3201处理后,没有改善BTBR小鼠的重复样行为;新生期ly3201预处理对BTBR小鼠的运动功能和焦虑行为未产生影响,提示ly3201特异性地改善了BTBR小鼠的社交行为;(3)采用BrdU和Sox2免疫组化染色检测海马齿回神经发生,BTBR小鼠海马齿回BrdU和Sox2的免疫反应阳性细胞显著少于C57组,新生期ly3201处理则增加BTBR小鼠海马齿回内BrdU和Sox2免疫反应阳性细胞数;2.移植hAEC对海马神经发生的作用及其对自闭症模型小鼠的治疗作用(1)hAEC移植至BTBR小鼠侧脑室1月后显著改善BTBR小鼠的社交障碍;对BTBR小鼠的重复行为、运动功能和焦虑行为未产生明显影响,提示hAEC注射特异性改善了BTBR小鼠的社交缺陷;(2)BTBR小鼠与C57小鼠比较,海马齿回神经发生受到抑制,神经前体细胞数量显著减少;hAEC移植则显著增加BTBR小鼠海马齿回内BrdU和DCX免疫反应阳性细胞及Sox2与GFAP双标记的神经前体细胞,提示hAEC移植显著增加BTBR小鼠海马齿回的神经发生。荧光定量PCR检测发现hAEC移植显著增加BTBR小鼠海马内干细胞标志物的表达,同时BDNF和TrkB的水平亦显著升高,提示hAEC通过上调海马内BDNF水平促进BTBR小鼠海马齿回的神经发生;(3)免疫调节亦可影响海马齿回神经发生。Iba1用于标记小胶质细胞,BTBR小鼠海马齿回内Iba1标记的小胶质细胞数量明显多于C57组,hAEC移植组对BTBR小鼠海马内Iba1免疫反应阳性细胞无显著影响;并且hAEC移植组对BTBR小鼠海马内IL1β、IL6、IL10、TNF、NF-kB mRNA水平亦无显著影响,提示hAEC移植对BTBR小鼠海马齿回神经发生的调控与免疫调节无明显相关性。研究结论:研究结果提示:新生期ly3201预处理和成年hAEC移植均可特异性改善BTBR小鼠的社交行为缺陷,并且这一效应与促进BTBR小鼠海马的神经发生密切相关。