Hedgehog(Hh)最早是在果蝇体内作为“体节极性”基因被发现,编码高度保守的糖蛋白。在脊椎动物中发现三种Hh同源基因:Sonic HH(SHH),Indian HH(IHH)和Destert HH(DHH).其中Sonic HH通路在调控脊椎动物胚胎发育上起着关键性的作用。当Shh信号通路紊乱时常导致胚胎发育畸形、出生缺陷、以及多种肿瘤的发生。正因为其与胚胎发育和人类疾病有着密切的联系,加强对Shh信号转导机制的了解,有助于更好的调控Shh信号通路和临床研制Shh信号小分子抑制剂,最终减少胚胎出生缺陷以及人类肿瘤的发生。在脊椎动物中,Hh信号转导发生是通过Hh配基结合12次跨膜受体蛋白Ptch,继而解除Ptch对7次跨膜蛋白Smo的抑制作用来实现对下游通路的转导。Hh配基与Ptch受体结合后通过内吞作用进入细胞内,而Smo激活进入原纤毛进而激活下游信号通路。Smo的下游是锌指转录因子Gli家族,包括Gli1、Gli2、Gli3三个成员,Hh靶基因的表达依赖于它们的活性。Sufu(SupressorofFused)是Shh信号通路下游一个关键性的调控因子,且作为Gli蛋白的分子伴侣,可以通过与Gli蛋白氨基端SYGH结构域物理性结合,从而将Gli蛋白滞留在细胞浆中,抑制Shh靶基因的表达。但是随着Hh通路的激活,Gli蛋白转运到胞核中,此时说明Sufu不再将Gli蛋白抑制在细胞浆中;也有数据显示Sufu本身是一个穿梭蛋白,能够在胞浆与胞核之间来回穿梭;上述结果暗示Sufu可能在细胞核内与Gli结合,进而调节Hh下游靶基因的表达。另外,Sufu可能作为Glis转录辅助抑制子,通过与转录核心抑制复合体中的SAP18蛋白结合,招募mSin3-HDAC转录共抑制子来抑制Gli蛋白的转录活性。Sufu在胞浆/核定位机制一直存在很大争议,我们课题组先前的研究发现Sufu在细胞核内的定位和Gli蛋白家族的三个成员都有关系,即与Gli激活子进入细胞核,与Gli抑制子一同转运出细胞核。利用组织芯片技术,通过检测18例人类髓母细胞瘤组织中Sufu的表达和分布,发现Sufu高表达且在细胞核内有明显的富集(N≥C 50%),同时,正常组织中Sufu定位均定位于细胞浆中;接着对其他Hh通路异常激活的肿瘤组织和细胞筛选时发现,在一些肺癌、乳腺癌的组织和细胞中Sufu与Gli1都一致高表达,这些结果都验证了先前的结论,即Sufu对于通路的最大激活起着正向调控的作用,且Sufu伴随着Gli激活子进入细胞核。Hh通路激活,Gli1高表达,Sufu也高表达,这就表明Sufu水平可能受到Gli蛋白的调控,于是我们检测Gli突变的的MEFs中Sufu蛋白周转速率,Sufu在几种Gli敲除的细胞系中的周转速率都快于在wt-MEFs,表明Sufu的稳定性与Gli蛋白家族的三个成员都有关系。此外蛋白质的翻译后修饰作用对蛋白的定位和稳定性也有影响,包括磷酸化、去磷酸化等。磷酸化修饰是一个可逆的过程,在Hh信号通路激活时,Sufu的稳定性降低,因为Sufu的双磷酸化修饰被解除,Sufu发生了去磷酸化,去磷酸化的Sufu不稳定,在细胞中更容易通过泛素-蛋白酶体途径进行降解,使得信号通路进一步激活。然而,我们并没有发现调控Sufu去磷酸化进行的磷酸酶。当我们通过分析与Sufu存在相互作用的蛋白质谱结果时发现了多个磷酸酶能够与Sufu蛋白结合,其中包括PPP4R2,并且当Hh信号通路激活时,PPP4R2与Sufu相互结合增强。因此我们推测Hh信号促进PPP4R2与Sufu相互作用,通过改变Sufu的磷酸化状态来影响其对Hh下游通路的调控。为了验证这一猜想,我们构建了带有Flag标签的PPP4R2基因的质粒,外源转染至HEK293T细胞,并通过免疫共沉淀实验验证了在HEK293T细胞里PPP4R2与Sufu能够相互结合,接着利用免疫荧光实验验证了在用ShhN-CM配基处理后的野生型小鼠成纤维细胞(wt-MEFs)中,PPP4R2与Sufu在细胞核中有明显的共定位。据此,我们猜想PPP4R2参与Sufu的磷酸化修饰并与其细胞内的定位和潜在的功能有直接关系。上述实验结果不仅找到了作用于Sufu的去磷酸化酶,而且发现了调控Sufu在细胞中定位的一种新机制,使我们对Sufu这一双向调控Hh通路的蛋白有了更加深入的认识。