白屈菜生物碱的提取及对犬抗病力的影响

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白屈菜又名山黄连,断肠草,为被子植物门,双子叶植物纲,罂粟科植物,在《救荒本草》中首次记载,属全草类,多年生草本植物。喜生于山谷沟壑阴凉之地,在中国大部分地区均有分布,取材方便,全草入药有镇痛,止咳,消肿,利尿,解毒等多种药理作用。含有多种生物碱,因其生物碱作用而被大众所认识。本实验对白屈菜生物碱进行提取富集,研究白屈菜生物碱活性成分对犬免疫和抗氧化功能的作用机理,并做出安全性评价。方法:(1)采集新鲜白屈菜,分为杀青与未杀青两部分,分别进行鲜菜使用,阴干,晒干,烘干处理,建立HPLC检测方法,通过HPLC验证其生物碱含量,并以白屈菜碱与白屈菜红碱作为评价指标。(2)使用处理过后的白屈菜全草采用煎煮法、热浸法、索式回流提取法进行白屈菜生物碱提取,探讨其适合的提取方式,并通过单因素结合响应面实验分析,优化提取工艺。并且对白屈菜生物碱进行大孔树脂富集实验,筛选了11种不同型号的树脂,寻找较为适宜的树脂型号,为该药的提取纯化提供依据。(3)对白屈菜生物碱进行临床应用,采用犬最大给药体积20m L/kg进行给药,并在给药后1d、3d、7d观察犬的健康状况、血液生化指标,对其安全性做出有效评价,同时对犬给药白屈菜生物碱1m L/kg,一日两次,连续饲喂21d,对免疫功能及其抗氧化功能进行检测,探讨白屈菜生物碱对犬免疫及其抗氧化功能的影响。结果:(1)通过比较,杀青前后白屈菜中白屈菜碱与白屈菜红碱含量无显著差异,采收新鲜白屈菜中白屈菜碱与白屈菜红碱含量最高,分别为9.876±0.625mg/g、2.321±0.015mg/g,其生物碱得率高达1.21%。将白屈菜阴干处理后,白屈菜碱与白屈菜红碱的含量流失最少,分别为5.643±0.327mg/g、0.924±0.013mg/g,其生物碱得率为6.56%。(2)通过对三种提取方法的比较,煎煮法对于生物碱成分的溶出效果最差,索式提取法的效果最好。单因素实验结合响应面实验分析,热浸法提取白屈菜生物碱数据优化结果为提取温度64.86℃,提取时间1.85h,盐酸使用浓度0.62%,计算所得白屈菜生物碱得率为0.756%。索式提取白屈菜生物碱数据优化结果为提取温度80.8℃,虹吸次数6.16次,盐酸浓度0.55%,计算所得白屈菜生物碱得率1.089%。(3)通过筛选,LX-28型树脂相较于其他型号树脂对白屈菜生物碱富集效果更为合适,吸附量为4.1mg/g,解析率为76%,动态洗脱下,使用80m L作为上样体积,160min树脂可达到饱和,白屈菜碱在300m L(30%乙醇)馏分时即可出现,但含量极少,其主要集中在的400m L(50%乙醇)馏分中被洗脱,浓度为最高,白屈菜红碱在425m L(75%乙醇)馏分时出现,主要被95%乙醇洗脱,浓度为最高。(4)在对犬的安全性实验中,在20m L/kg(相当于生药量20g/kg)的剂量下空白组与给药组的各项指标无显著差异(P>0.05)。并且1m L/kg的剂量下白屈菜生物碱可显著提高犬的免疫功能,给药后第7d、14d、21d,犬血清中免疫球蛋白Ig A、Ig G、Ig M含量明显提高,血清中炎性因子IL-1、IL-6,干扰素INF-γ含量明显提高,给药组显著高于空白对照组(P<0.05)。同时抗氧化酶活性也明显提高,血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性对比空白组显著升高(P<0.05),丙二醛MDA在血清中含量跟空白组相比明显降低(P<0.05)。结论:白屈菜采收后建议直接使用,通过阴干处理可以使白屈菜生物碱的丢失明显降低,索式提取法使用提取温度为80℃,虹吸次数为6次,盐酸浓度为0.55%的参数进行提取可以明显增加白屈菜提取液中生物碱含量。采用20m L/kg(生药20g/kg)的剂量对犬进行给药,基本无毒性。并且采用1m L/kg一日两次的剂量连续给药21d可显著提高犬的免疫功能,增强其抗病力与抗氧化能力,该实验为白屈菜的临床应用提供参考。
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