研究目的:制备放射状多孔纳米壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HAp）复合支架,分别检测其体外细胞相容性和细胞活性,以及体内组织相容性,最终探究其引导体内骨再生同时排除非成骨性细胞和纤维组织干扰正常骨再生的能力。研究方法:1)首先从当地市场获取猪大腿骨,去除干净表面附着的肌肉、筋膜、骨膜,以及髓腔中的松质骨和骨髓,得到管状皮质骨,经过物理和化学方法去除剩余脂肪和胶原成分后得到HAp。将CS溶液与HAp简单混合搅拌后制成均质匀浆,随后通过定向冷冻铸造法获得放射状多孔CS/HAp复合支架。2)通过X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和透射电子显微镜（TEM）检测手段对制备的HAp粉末进行表征,确定所制备的无机骨粉为纳米级HAp;而后通过摄影拍照、光学显微镜（OM）和装配了X射线能谱仪（EDS）的场发射扫描电子显微镜（FESEM）对支架材料进行表征,观察所制备支架的形貌、孔隙大小及结构和元素分布;通过显微计算机断层扫描（MicroCT）对支架的三维（3D）结构进行表征;通过压汞法对支架的孔隙率和孔隙大小进行测量;通过万能力学测试仪器检测所制备支架的力学性能。3)从3周龄的斯普拉格-杜勒鼠（SD）中获得股骨和胫骨,体外分离获取骨髓间充质干细胞（BMMSCs）,贴壁培养。当细胞融合度达到80%～90%时,用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化后,1:2传代,第3～4代细胞用于后续实验。通过倒置相差显微镜观察P0、P1、P2和P3代BMMSCs的生长情况和细胞形态特征,并拍照记录;通过流式细胞仪鉴定BMMSCs表面的特异性抗原,如CD29、CD90、CD45、CD11b/c。4)将单向、放射状多孔CS/HAp复合支架和纯CS多孔支架与BMMSCs进行共培养,于培养第1,3,7d检测细胞毒性;将BMMSCs分别种植在单向、放射状多孔CS/HAp复合支架和纯CS多孔支架上,于第3,7d观察BMMSCs在上述支架上的增殖、粘附、活性及形态的变化。5)利用碱性磷酸酶（ALP）染色法对BMMSCs的成骨分化能力进行检测。将单向、放射状多孔CS/HAp复合支架和纯CS多孔支架与BMMSCs进行共培养,分别于培养第7、14d行ALP染色,观察染色的程度。6)将单向、放射状多孔CS/HAp复合支架和纯CS多孔支架植入SD大鼠的背部皮下袋中,分别于植入后的第14和28d将支架取出,摄影拍照后行组织学检测其炎症反应,以及周围细胞和组织侵入支架情况。7)制备兔骨缺损模型,35只2.5Kg的新西兰大白兔,随机分成4组。麻醉固定消毒后,在双侧远端股骨上做一个3cm的切口,将皮肤层、皮下组织和肌肉逐层剥离,以暴露股骨髁。随后,用牙钻在股骨外侧髁处制造一个直径6.5 mm,深度7 mm圆柱状缺损,穿透皮质骨到达松质骨处,用生理盐水冲洗所制备的缺损以去除骨碎片。按照4种不同的方式修复骨缺损:空白组:造成骨缺损而未给予其他治疗措施,直接缝合关闭伤口;放射状多孔CS治疗组:将制备的放射状CS支架植入骨缺损中;单向多孔CS/HAp复合支架治疗组:将制备的单向多孔CS/HAp复合支架植入骨缺损中;放射状多孔CS/HAp复合支架治疗组:将制备的放射状多孔CS/HAp复合支架植入骨缺损中。分别在饲养6周和12周后处死动物,获取膝关节标本。大体观察并对膝关节标本进行拍照;利用micro-CT对每组骨缺损的修复效果进行评估和比较;用苏木精—伊红染色法（HE）和马松三色染色法（MT）观察骨缺损的修复效果。研究结果:1、通过相关检测手段证实成功制得纳米级HAp。随后通过相关检测手段证实,利用冷冻铸造法成功制备了放射状及单向多孔CS/HAp复合支架。2、放射状多孔CS/HAp复合支架的平均孔隙率和平均孔隙大小分别为97.63%,孔宽84μm,孔长219μm;单向多孔CS/HAp支架的平均孔隙率和平均孔隙大小分别为90.23%,孔宽98μm,孔长230μm。通过轴向压缩试验表明,多孔CS/HAp复合支架相对于多孔CS支架具有明显更高的机械强度和弹性模量,其中单向多孔CS/HAp复合支架的屈服强度高于单向多孔CS支架。此外,单向多孔CS/HAp复合支架在相同的应变（60%）下能够承受较大的压力负荷,但在较低的应变（约10%）下开始塑性变形,而放射状多孔CS/HAp复合支架在应力-应变曲线上则有较大的弹性变形区域。3、从SD大鼠的体内成功分离出BMMSCs,经贴壁生长后,倒置相差显微镜观察发现P0和P1代细胞呈现梭形及多角形,同时有许多杂细胞存在;当细胞传至P2代时,则呈现均匀分布生长,形态呈梭形,以纤维及网状形态排列;P3代细胞则呈现长梭形、纤维样,细胞伪足逐渐伸展开,形态单一。4、在体外生物相容性评价方面,利用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测证实CS和CS/HAp支架组在细胞培养7d后均有显著的细胞增殖,与空白对照组（无支架）相当。在细胞培养的第3、7d,双乙酸荧光素（FDA）荧光染色进一步验证了CS和CS/HAp支架的无毒性,并显示了BMMSCs在不同结构支架中沿孔道的分布和迁移行为。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对细胞骨架和细胞核荧光染色的观察显示,在CS/HAp复合支架上培养3d后,BMMSCs在CS/HAp复合支架通道壁上均表现出良好的粘附和增殖。培养7天后,BMMSCs的细胞骨架在CS/HAp复合支架上发育良好,细胞形态呈梭形分布于支架的孔道内。通过SEM进一步观察显示,在CS和CS/HAp支架上孵育3d后,BMMSCs在CS/HAp复合支架的通道壁上展开相对有限的丝状伪足;而孵育7d后,细胞密度显著增加,BMMSCs丝状伪足增加,并完全扩散到CS/HAp支架的通道壁上。5、对与BMMSCs共培养的CS和CS/HAp支架（1:1和1:2）进行体外ALP染色检测,在共培养第7d时,相对于纯CS支架组和空白对照组,CS/HAp复合支架组染色较深,而在共培养第14d时,放射状多孔CS/HAp复合支架（1:2）组染色最深,同时各组的颜色相对于第7天都有所加深。6、在评价CS和CS/HAp支架在体内的生物相容性和组织反应方面,采集的样品照片显示,CS和CS/HAp支架在体内14d后均覆盖了一层较厚的纤维囊,在体内28d后纤维囊厚度明显降低。采集标本的HE染色显示,第14d标本周围有明显的炎性细胞聚集和浸润,第28d炎症细胞减少。同时可见纤维组织从放射状多孔支架外围向支架内浸润明显,从单向多孔支架的两端向支架浸润明显。值得注意的是,植入28d后纤维组织浸润深度和面积明显增强。然而,因为没有开放的孔隙,细胞和纤维组织不易从垂直于通道的方向渗透到支架中。7、在兔股骨缺损修复的第6和12周,micro-CT三维重建和二维横切面切片显示,相对于空白组,支架植入组缺损边缘有明显的新生骨形成。此外,新形成的骨可以沿周围孔道有效地长入放射状多孔CS/HAp复合支架内,然而,新形成的骨则主要分布在单向多孔CS/HAp复合支架的周围。Micro-CT定量分析结果显示,在骨缺损修复的第6、12周,放射状多孔CS/HAp复合支架组新骨体积/总缺损体积（BV/TV）的比值在各组中最大。骨体积（BV）值在放射状多孔CS/HAp复合支架组中也最高。此外,放射状多孔CS/HAp复合支架组的骨小梁数量（Tb.N）值显著高于其他组,而小梁分离（Tb.Sp）值在各组中最低。8、HE和MT组织染色显示,在支架植入后6周,由于缺乏开放的孔隙,纤维组织被阻挡在放射状多孔CS/HAp复合支架顶部和底部外,而纤维组织会沿着连通到顶部的孔隙通道侵入到单向多孔CS/HAp复合支架内部。同时值得注意的是,放射状多孔CS支架发生了明显的降解。在支架植入后12周,所有组均显示新骨形成增加。从HE和MT染色图像可以明显观察到新形成的骨沿孔道长入到放射状多孔CS/HAp复合支架中。而新形成的骨则分布在单向多孔CS/HAp复合支架周围,同时支架内部孔道被大量纤维组织覆盖。结论:1、通过改进的冷冻铸造技术成功地制备了具有放射状多孔结构的CS/HAp纳米复合支架。2、CS/HAp复合支架的放射状多孔结构表现出结构和力学各向异性,抗压缩变形能力增强,可以避免了结构坍塌。3、所制备的多孔CS/HAp复合支架具有良好的生物相容性,有利于细胞在体外沿孔道的粘附和迁移。此外,体内动物研究表明,多孔CS/HAp复合支架可诱导低炎症反应,且放射状多孔结构促进骨修复相关常驻细胞沿孔道向支架内迁移和浸润,同时能够阻断非成骨性细胞和纤维组织沿支架纵向进入支架,确保正常的骨组织重塑过程。