Sly-miR171d/e调控番茄果实采后衰老的表观遗传学机制研究

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成熟和衰老是植物生命周期中重要的阶段。随着生长发育进程,不同的植物器官会产生不同的表观遗传失调模式,组织内的稳态逐渐丧失,导致一系列与衰老相关的生理变化的出现。番茄是人类饮食中重要的营养来源,也是研究呼吸跃变型果实的典型模型。深入对番茄果实成熟和衰老的分子调控机制的研究,能够为其他呼吸跃变型果实衰老调控机制研究提供理论指导。Micro RNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类高度保守的单链非编码RNA,长约18~25 nt,通常在转录后水平上介导m RNA靶分子的切割或抑制靶分子的翻译,从而对靶基因的表达产生负调控作用。miR171家族作为保守的miRNA家族之一,在花粉发育、叶绿素的合成和复叶发育等过程中具有调控作用,但是在果实的成熟和衰老调控中仍缺乏了解。本研究采用生物信息学、STTM(short tandem target mimic)技术、植物遗传转化和实时荧光定量PCR等手段,探究了miR171d/e-SlGRAS24模式在番茄生长发育及成熟和衰老过程中的功能,明确了miR171d/e对番茄生长发育性状、果实成熟和衰老等的影响,主要结论如下:(1)本研究以Micro-Tom番茄为材料,利用STTM技术构建番茄miR171d和miR171e干扰载体,并通过遗传转化获得转基因番茄植株。对番茄中miR171d/e及靶基因SlGRAS24的表达模式进行了分析,发现miR171d在番茄大多数组织中的表达量远远高于miR171e。而二者对应的靶基因SlGRAS24都在茎中表达量最高。(2)miR171d/e功能抑制后的STTM171d/e转基因番茄植株变矮、叶片形态改变、萼片变小以及花粉粒饱满等性状,表明miR171d/e在番茄生长发育中具有重要的调控作用。通过q RT-PCR分析显示,STTM171d/e通过负调控靶基因SlGRAS24表达的上调,导致叶片中叶绿素的积累和萼片显著变小。因此我们推测SlGRAS24与叶片颜色和萼片大小呈正相关。(3)miR171d/e功能的抑制可能对STTM171d/e番茄果实发育和成熟具有重要的作用。通过观察开花后7天的番茄果实果皮细胞层数,发现STTM171d/e果皮细胞层数相比野生型明显增加。并进一步对其表达量进行测定,发现靶基因SlGRAS24在STTM171d/e番茄果实中较高,且miR171d/e与SlGRAS24呈负相关,说明番茄果实在早期发育中的细胞膨大可能与miR171d/e-SlGRAS24模式有关。早期果实的发育可能影响了采前果实的成熟。miR171d/e受到干扰后表达量下调,导致STTM171d/e番茄果实提前破色,说明miR171d/e负调控果实成熟。(4)miR171d/e参与了番茄果实采后成熟和衰老的调控。通过测定番茄果实成熟期间乙烯释放量以及类胡萝卜素合成途径中Sl PSY1、Sl PDS、Sl ZDS、Sl LCY-Beta和Sl LCY-E基因的表达,发现miR171d/e功能的抑制导致呼吸跃变进程提前、类胡萝卜素合成基因的表达上调,促进了类胡萝卜素的合成和积累,从而影响了果实破色时间。总之,Sly-miR171d/e通过调控SlGRAS24影响番茄生长发育和果实成熟和衰老,本研究为Sly-miR171调控番茄果实采后衰老的表观遗传学研究提供了理论指导。
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