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羊传染性脓疱病（Orf）又称羊接触传染性脓疱皮炎,俗称“羊口疮”,是由羊传染性脓疱病毒（Orf virus,ORFV）感染引起的一种急性、高度接触性传染病。ORFV主要感染绵羊、山羊,牧民及从事屠宰、兽医等行业的工作人员也常发生感染,因此该病原也是一种重要的人兽共患病病原,对养羊业及人类健康构成严重威胁。ORFV基因组庞大,编码蛋白众多,ORFV120基因位于病毒基因组末端,与其它痘病毒无明确匹配的基因,功能未知。鉴于ORFV基因组末端区多编码与病毒毒力、致病及免疫调节相关的基因,推测ORFV120基因可能是编码与发病机制和毒力相关的因子。为明确ORFV120基因的功能,本研究首先以OV-SY17为亲本毒株,利用同源重组技术对ORFV120基因进行敲除,成功构建出携带绿色荧光蛋白GFP的OV-SY17Δ120基因缺失毒株;并以p UC18为骨架质粒,构建出红色荧光蛋白RFP标记的OV-SY17-RV120回转毒株。病毒生长曲线测定结果显示,重组毒株OV-SY17Δ120和OV-SY17-RV120与OV-SY17亲本毒株生长规律基本一致,病毒滴度无明显变化,表明ORFV120基因缺失不影响其在宿主细胞的复制,为病毒复制非必需基因。本源动物回归试验结果显示,OV-SY17和OV-SY17-RV120毒株接种羔羊均出现典型口疮病变,且在感染后第3 d即可观察到,而OV-SY17Δ120基因缺失毒株接种羔羊在早期仅出现轻微红肿,后期消退;该结果表明,ORFV120基因是病毒编码的一个重要毒力基因。本研究进一步对ORFV120蛋白的细胞定位与表达特性进行检测,激光共聚焦观察可见ORFV120蛋白主要分布于感染宿主细胞的胞质内,呈点状分布,偶尔可见细胞核有少量分布。阿糖胞苷（Ara C）是常用的病毒晚期DNA合成抑制剂,在加入Ara C情况下,利用RT-PCR和实时荧光定量PCR对病毒ORFV120基因的表达进行检测,结果显示,在病毒感染早期（0.5h）即可检测到ORFV120基因的表达,证实ORFV120基因为病毒编码的早-晚期表达基因。基于上述结果,本研究应用RNA-seq转录组测序技术,探索ORFV120基因对宿主细胞m RNA转录的影响。分析结果发现,在ORFV120基因缺失毒株感染细胞,NF-κB信号通路相关的一些调节因子,例如NF-κBIA、ICAM1、IL-8、PTGS2等m RNA显著下调表达,该结果提示ORFV120蛋白对NF-κB信号通路具有调节作用。作为参与宿主先天免疫应答调控的一类转录因子,NF-κB在介导炎症、免疫、细胞增殖、分化及凋亡等方面发挥重要作用。ORFV被公认为具有强大的免疫调节功能,至少在部分程度上被认为与其能够表达一系列靶向宿主炎症通路的免疫调节因子有关,目前病毒多个编码蛋白（ORF002、ORF024、ORF073、ORF119、ORF121）已被证实可通过抑制NF-κB信号通路阻断、破坏宿主对感染的反应,以利于病毒侵染。由此可见,NF-κB通路是ORFV对宿主进行免疫调节的重要靶标之一。然而,ORFV120蛋白对NF-κB信号通路确切的调控作用及机制尚需要深入研究。接下来,本研究首先利用双荧光素酶报告系统检测ORFV120蛋白对NF-κB-p65转录活性的影响,结果显示,OV-SY17Δ120基因缺失毒株激活NF-κB-p65转录水平低于OV-SY17野生型毒株和OV-SY17-RV120回转毒株,提示ORFV120蛋白对NF-κB-p65转录具有促进作用。此外,利用WB方法对OV-SY17、OV-SY17Δ120以及OV-SY17-RV120毒株感染宿主细胞后不同时间点IKKα/β复合物、IκBα和p65的磷酸化水平进行检测,在OV-SY17Δ120毒株感染宿主细胞,它们的磷酸化水平均低于OV-SY17野生型毒株;而在回转ORFV120基因后,其诱导IKKα/β复合物、IκBα和p65的磷酸化水平与OV-SY17野生型毒株相当。进一步利用激光共聚焦技术检测p65入核情况,其中OV-SY17Δ120毒株感染细胞中p65入核水平低于OV-SY17和OV-SY17-RV120毒株。当过表达GFP-120蛋白时,WB方法检测结果显示,ORFV120蛋白可通过磷酸化IKKα/β复合物、IκBα,进而释放p65,使其磷酸化后入核。此外,进一步利用核质分离实验检测p65入核情况,在细胞核中能够检测到p65,表明ORFV120蛋白能够激活NF-κB信号通路。然而,在OV-SY17野生型毒株感染后期阶段,NF-κB通路的活化程度受到抑制,这或许与ORFV在感染后期进化出其它一些NF-κB通路抑制剂有关,该结果表明OV-SY17野毒株在感染早期激活NF-κB通路可能依赖于ORFV120蛋白。通过以上试验,本研究证实ORFV120蛋白能够激活NF-κB信号通路,然而激活机制尚不清楚。为阐明ORFV120蛋白对NF-κB信号通路的调控机制,本研究利用酵母双杂交-膜系统成功筛选获得与ORFV120蛋白互作的宿主蛋白Ras GTP酶活化蛋白结合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein-binding protein 1,G3BP1）,其是哺乳动物细胞应激颗粒（Cell stress granules,SGs）的关键组成成分之一。利用免疫共沉淀（Co-IP）和激光共聚焦共定位观察进一步证实ORFV120蛋白与G3BP1蛋白存在互作。为明确ORFV120蛋白与G3BP1蛋白的结合位点,构建G3BP1蛋白截短体,利用Co-IP筛选鉴定出G3BP1NTF2和G3BP1Pxx P结构域是ORFV120蛋白的主要结合位点。然而,G3BP1蛋白是否参与ORFV120蛋白对NF-κB信号通路的活化尚需证实。首先利用WB方法对OV-SY17、OV-SY17Δ120以及OV-SY17-RV120毒株感染宿主细胞中G3BP1的表达情况进行检测,结果显示,在OV-SY17野生型毒株感染宿主细胞中,G3BP1蛋白呈先上升后下降趋势;而与OV-SY17和OV-SY17-RV120毒株相比,OV-SY17Δ120基因缺失毒株感染细胞中G3BP1蛋白表达量有所下降。在过表达ORFV120蛋白情况下,G3BP1蛋白表达水平升高,该结果表明ORFV120蛋白能够促进G3BP1蛋白的表达。在利用si RNA技术干扰G3BP1蛋白表达的情况下过表达ORFV120蛋白,利用WB方法对NF-κB通路中IKKα/β复合物、IκBα和p65的磷酸化水平进行检测,结果显示,干扰G3BP1蛋白表达后IKKα/β复合物、IκBα和p65的磷酸化水平明显降低。而在利用si RNA技术干扰G3BP1蛋白表达的情况下接种OV-SY17和OV-SY17Δ120毒株,结果显示,在ORFV120基因存在的情况下,干扰G3BP1蛋白表达导致IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化水平显著降低,从而证实G3BP1参与ORFV120蛋白对NF-κB信号通路活化过程。此外,双荧光素酶报告系统检测显示ORFV120蛋白通过G3BP1蛋白全长或G3BP1RRM+RGG结构域正向调节NF-κB信号通路的活化。综上所述,本研究系统开展了针对ORFV120蛋白的功能研究,证实ORFV120蛋白是可正向调控NF-κB免疫调节信号通路的毒力基因。本研究重点揭示了ORFV120蛋白活化NF-κB信号通路的分子机制,ORFV120蛋白能够与宿主G3BP1蛋白的G3BP1NTF2和G3BP1Pxx P结构域结合,并通过G3BP1蛋白全长或G3BP1RRM+RGG结构域正向调节NF-κB信号通路的活化。该项研究不仅丰富了针对ORFV未知功能基因功能研究的资料,填补了ORFV120蛋白功能研究上的空白;而且揭示了ORFV120蛋白对NF-κB信号通路的调控机制,为全面阐明ORFV免疫逃逸机制奠定基础,并对ORFV疫苗设计和抗病毒药物的设计提供重要的思路。