【摘 要】
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柞蚕是我国一种重要的经济昆虫,但在从幼虫到成虫的四个阶段很容易受到病原微生物的感染,对柞蚕产业造成了巨大的经济损失,因此,研究其病害防治在蚕业经济里尤为重要。柞蚕依赖天然免疫系统抵御外源微生物的入侵,其中模式识别受体对于昆虫体液免疫至关重要,他们能够识别病原模式相关分子,即细菌表面的脂多糖、肽聚糖等。两者之间的相互作用能启动宿主防御机制,从而保护柞蚕自身免受病原微生物的侵害。Malectin是一种
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柞蚕是我国一种重要的经济昆虫,但在从幼虫到成虫的四个阶段很容易受到病原微生物的感染,对柞蚕产业造成了巨大的经济损失,因此,研究其病害防治在蚕业经济里尤为重要。柞蚕依赖天然免疫系统抵御外源微生物的入侵,其中模式识别受体对于昆虫体液免疫至关重要,他们能够识别病原模式相关分子,即细菌表面的脂多糖、肽聚糖等。两者之间的相互作用能启动宿主防御机制,从而保护柞蚕自身免受病原微生物的侵害。Malectin是一种新发现的内质网凝集素,参与糖蛋白的质量控制,具有免疫潜能。本研究对柞蚕Malectin（Ap MLEC）进行克隆、蛋白表达纯化和初步功能分析,结果如下:通过PCR克隆Ap MLEC基因,并对序列进行生物信息学分析,结果表明该基因包含798个碱基,编码266个氨基酸。全长Ap MLEC蛋白的预测分子量为29.9 k Da,等电点为5.12,1-21位氨基酸为信号肽,介导碳水化合物相互作用的四个芳香残基是Y77、Y99、Y109和F110,244-263位氨基酸为跨膜结构域,26-188位氨基酸为Malectindomain结构域。将Ap MLEC序列信息提交至NCBI-Gen Bank数据库,登录号为OL519584。将基因连接至p ET-28a原核表达载体,经过原核表达和亲和层析法纯化得到分子量约为33 k Da,带有组氨酸标签的重组蛋白。通过该蛋白结合多糖、凝集细菌和抑菌能力的实验结果证实,Ap MLEC能够与麦芽糖、异麦芽糖、脂多糖和肽聚糖发生结合;凝集细菌;并抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,最小抑菌浓度均为250μg/m L。为了检测Ap MLEC对Ap NPV病毒复制增殖的作用,本研究将纯化的Ap MLEC与Ap NPV/egfp重组病毒等体积添加至Tn-High Five细胞,通过egfp荧光蛋白的表达情况确定其抗病毒作用。为鉴定内源性Ap MLEC对Ap NPV病毒的抑制作用,将Ap MLEC基因和Ap MLEC-突变体基因,分别连接至转移载体p Ap Bac Dualegfp,将两种表达载体均分别转染细胞和柞蚕蛹,探究其抗病毒作用。结果显示,内源性表达的Ap MLEC能抑制Ap NPV病毒的复制表达。以上结果表明Ap MLEC可能在柞蚕天然免疫中发挥重要作用,为今后开展柞蚕免疫系统的研究奠定基础。
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