食欲素A作为一种重要的神经肽类激素,通过与G蛋白偶联受体结合影响生殖功能。为研究食欲素A对绵羊黄体化颗粒细胞的基因表达的影响及其信号网络,参照本实验室已经建立的绵羊卵巢颗粒细胞培养体系进行细胞培养,在颗粒细胞内联合添加FSH、LH、E2,用ELISA进行鉴定是否黄体化;提取黄体化颗粒细胞组和添加Orexin A的黄体化颗粒细胞组的RNA,采用Illumina测序技术进行测序,用生物信息学方法对转录组数据进行分析,在测序数据质量控制合格的基础上,对差异表达的基因进行筛选、功能注释和富集分析;运用荧光定量PCR和Western blot对差异显著基因进行验证;其中筛选出的PRRT2可能参与cGMP-PKG、MAPK、Wnt等信号通路影响黄体化颗粒细胞孕酮分泌,所以对PRRT2进一步验证,在黄体化颗粒细胞和外加OrexinA的黄体化颗粒细胞添加不同浓度(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)PRRT2抑制剂(HY-10230),ELISA检测上清液中孕酮分泌量,WB检测添加HY-10230和Orexin A的黄体化颗粒细胞中PRRT2和StAR含量。结果表明,黄体化颗粒细胞组的孕酮分泌量显著高于未黄体化颗粒细胞组,表明卵巢颗粒细胞已被黄体化;转录组测序共获得了 123个差异基因,其中上调表达54个,下调69个;发现多个与细胞周期调控、繁殖及代谢相关的高表达基因,结合GO分析和KEGG通路分析表明差异基因主要参与代谢途径、氧化磷酸化、癌症信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路、转录调控等;运用q-PCR对筛选出的与生殖、代谢、细胞增殖凋亡相关的差异显著基因(PRRT2、ATP8、KIRREL、ID1、SOX4、TBX3)进行验证,ATP8、PRRT2、KIRRE 在添加OrexinA后表达量显著上升(P<0.05),ID1、SOX4、TBX3在添加OrexinA后表达量显著下降(P<0.05),其结果与测序结果一致;对PRRT2进一步采用WB的验证,添加HY-10230孕酮分泌量显著下降(P<0.01),并且最佳抑制浓度为1μmol/L;PRRT2、StAR蛋白表达量在添加Orexin A后显著升高(P<0.05),添加HY-10230后PRRT2、StAR表达量显著降低(P<0.05),WB结果与测序结果一致,并说明Orexin A可通过PRRT2影响孕酮的分泌。本试验为探索Orexin A影响绵羊的黄体化颗粒细胞基因表达和生殖调控提供了参考。