【摘 要】
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目的:制备茶藨子木层孔菌多糖PRG并表征其特征;确定PRG对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)及过氧化氢（H2O2）损伤PC12神经细胞的保护作用;对PRG进行氧化降解,以降解产物作用下Aβ25-35损伤的PC12细胞存活率大小为指标,响应面法优化降解工艺,在最优条件下降解得DPRG,对其分子量、单糖组成、红外光谱进行表征;从分子水平上,阐明DPRG发挥神经保护作用可能的机制。方法:采用水提醇沉、去蛋
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目的:制备茶藨子木层孔菌多糖PRG并表征其特征;确定PRG对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)及过氧化氢（H2O2）损伤PC12神经细胞的保护作用;对PRG进行氧化降解,以降解产物作用下Aβ25-35损伤的PC12细胞存活率大小为指标,响应面法优化降解工艺,在最优条件下降解得DPRG,对其分子量、单糖组成、红外光谱进行表征;从分子水平上,阐明DPRG发挥神经保护作用可能的机制。方法:采用水提醇沉、去蛋白、分级醇沉、离子交换层析、超滤法逐步纯化得到PRG,HPGPC法测定分子量,气相色谱（GC）确定其单糖组成,红外、紫外光谱等对其结构进行初步分析;通过MTT实验,检测PRG对Aβ25-35及H2O2损伤的PC12神经细胞活力的影响;采用H2O2-Vc氧化降解法对PRG降解,以降解产物作用下PC12细胞存活率的大小为指标,采用响应面法优化H2O2-Vc浓度、降解温度及降解时间三个因素在高中低水平上对降解产物的影响;最优条件下降解得低分子量多糖DPRG,采用GC、红外光谱分析DPRG的单糖组成及结构信息,HPGPC测定其重均分子量;利用MTT法、流式细胞术、线粒体膜电位测定（MMP）、Western blotting分析DPRG对PC12细胞活力及凋亡相关机制的影响。结果:茶藨子木层孔菌多糖PRG分子量为5.76 k Da,由葡萄糖组成;PRG在10-500μg/m L对正常神经细胞不产生毒性作用,与模型组中细胞相比,PRG高、中剂量组均能减小Aβ25-35及H2O2引起的神经细胞死亡,提高其存活率;PRG的最佳降解条件为:H2O2-Vc浓度为16.98 m M,降解时间为1.57 h,降解温度为51.06 oC,考虑到实际操作的方便性,将其调整为H2O2-Vc浓度为17 m M,降解时间及温度分别为1.6 h、50 oC,在此条件下降解,PC12细胞在降解产物作用下细胞实际存活率为83.38%,与预测值（83.49%）相差不超过0.15%;DPRG的重均分子量为3.06 k Da,由葡萄糖组成,结合红外光谱分析,与PRG相比,降解未明显改变其单糖结构;10、50、150μg/m L DPRG均能减弱Aβ对PC12细胞造成的损害,其中高、中剂量组能明显增加细胞活力、提高MMP,各剂量组均能有效抑制PC12细胞的凋亡且150μg/m L DPRG组能降低线粒体细胞色素C（Cytochrome C）蛋白的表达。结论:成功制备了茶藨子木层孔菌多糖PRG并确定了其神经保护活性;响应面法优化的多糖降解工艺具有较好的预测性,可以应用;降解过程未明显改变PRG的结构;DPRG能够提高损伤神经细胞的存活率,其机制与增加PC12细胞中MMP水平和降低Cytochrome C蛋白表达来抑制细胞凋亡有关。本研究为茶藨子木层孔菌多糖今后在临床上的应用打下了良好的基础。
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