第一部分外周血ACE水平、活性及I/D基因多态性与2型糖尿病轻度认知功能障碍的相关性研究背景:血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme,ACE）是肾素-血管紧张素系统（reninangiotensin system,RAS）的关键酶,与2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）及阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的发生发展均密切相关。T2DM可并发不同程度的认知功能障碍,包括轻度认知功能障碍（Mild Cognitive Impairment,MCI）和痴呆。MCI是一种介于正常衰老与痴呆之间的过渡阶段。目的:本研究旨在探讨外周血ACE水平、活性及ACE I/D基因多态性与2型糖尿病轻度认知障碍的相关性。方法:本研究共招募210例T2DM患者,根据蒙特利尔认知评估（Montreal cognitive assessment,Mo CA）得分,将T2DM患者分为MCI组116例,非MCI组94例。收集患者的社会人口学资料、临床资料;使用多维度神经学量表评估受试者认知功能;采用酶联免疫吸附法测定血清ACE含量,并使用紫外分光光度法测定血清ACE活性;使用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法检测ACE I/D基因多态性。结果:1、MCI组与非MCI对照组相比,患者空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,Hb A1c）、血清ACE水平及ACE活性明显升高（p<0.05）,空腹C肽（fasting C-peptide,FCP）水平明显降低（p<0.05）,Mo CA得分及各项认知功能得分明显降低（p<0.05）。2、在T2DM-MCI人群中,ACE活性分别与Mo CA、逻辑记忆功能测验（logical memory test,LMT）之间呈显著负相关（r=-0.242,p=0.009;r=-0.286,p=0.002）。3、在T2DM-MCI人群中,多元线性回归结果显示,在校正了年龄、教育水平、FBG、糖尿病病程、高血压病程、血脂水平等因素后,ACE活性是LMT得分的一个危险因素（β=-0.186,p=0.035）。4、MCI组与非MCI组之间的ACE I/D基因型、等位基因频率分布均无明显统计学差异。但在T2DM-MCI人群中,DD基因型对应的血清ACE水平、ACE活性均明显高于ID、II基因型（p<0.05）。结论:在T2DM人群中,MCI患者的血清ACE水平及活性均高于认知功能正常者,其中增加的血清ACE活性与T2DM患者认知功能障碍相关,尤其是记忆功能障碍。此外,需要进一步研究证实ACE的D等位基因可能是T2DM记忆功能障碍的一个候选基因。第二部分RAS在KK-Ay小鼠认知功能障碍中的作用背景:慢性高血糖是2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）的主要临床表现之一,慢性高血糖可激活体内肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）,脑内RAS激活可进一步导致认知功能障碍的发生发展,但其具体的分子机制尚未明确。脑淀粉样蛋白假说是T2DM认知功能障碍的几大发病假说之一,β淀粉样蛋白（amyloid beta,Aβ）由β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）经过β和γ分泌酶剪切生成。我们前期的研究结果发现,T2DM认知功能障碍的患者外周血血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme,ACE）水平及活性均升高,其中血清ACE活性与T2DM患者认知功能障碍相关,尤其是记忆功能障碍。目的:在临床研究的基础上,我们进一步通过动物实验来研究RAS参与T2DM认知障碍的发病机制,观察T2DM认知功能障碍小鼠脑内RAS系统ACE-AngⅡ-AT1R轴蛋白水平,脑内APP、Aβ代谢水平;以及卡托普利、氯沙坦、PD123319对2型糖尿病认知功能障碍小鼠中的干预效应。方法:选取8周龄KK-Ay小鼠予以专用饲料喂养作为实验组,8周龄C57BL/6小鼠作为对照组,在8周龄、20周龄时处死两组小鼠。选取20周龄KK-Ay小鼠继续喂养,随机分组,每天分别予以卡托普利（5 mg/kg/d）、氯沙坦（10 mg/kg/d）、PD123319（10 mg/kg/d）灌胃8周,对照组给予等体积生理盐水灌胃20周龄KK-Ay小鼠8周,各组小鼠喂养至28周龄时处死。每周监测小鼠体重、空腹血糖。处死前眼球内眦静脉取血,检测空腹血胰岛素水平,计算出胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）水平;采用Morris水迷宫实验和明暗箱被动回避实验,检测小鼠的学习、记忆功能。处死后,取脑组织切片,进行HE染色和尼氏染色,观察小鼠脑组织中海马部位的神经元形态学和尼氏小体的改变;Western blot检测小鼠海马组织ACE、AT1R、AT2R、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、p-JNK、p-APP Thr 668、APP蛋白的表达水平;同时检测小鼠海马组织匀浆ACE活性、AngⅡ、Aβ40、Aβ42水平;免疫荧光染色检测小鼠脑组织中海马部位的p-JNK、p-APP Thr 668蛋白的表达情况。结果:1、20周龄KK-Ay小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR水平明显高于20周龄C57BL/6小鼠（P<0.05）,且20周龄KK-Ay小鼠空腹血糖均≥11.1mmol/L,符合T2DM诊断标准;分别予以卡托普利、氯沙坦、PD123319干预20周龄KK-Ay小鼠后,各组空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR水平与生理盐水对照组相比无明显统计学差异（P>0.05）。2、Morris水迷宫实验结果显示,20周龄KK-Ay小鼠与20周龄C57BL/6小鼠相比,其寻找平台潜伏期明显延长,穿梭目标平台的正确次数明显减少（P<0.05）;明暗箱避暗实验结果表明,避暗潜伏期（即错误进入暗区的潜伏期）明显缩短,错误次数明显增加（P<0.05）。与生理盐水对照组相比,卡托普利组、氯沙坦组小鼠的水迷宫寻找平台潜伏期明显缩短,穿梭目标平台的正确次数明显增加（P<0.05）;明暗箱避暗潜伏期明显延长,错误次数明显减少（P<0.05）。而PD123319干预组与生理盐水对照组相比,上述指标无明显统计学差异（P>0.05）。3、HE染色和尼氏染色结果显示,20周龄KK-Ay小鼠与20周龄C57BL/6小鼠相比,大脑海马部位的神经细胞出现排列松散、结构破坏的现象,尼氏小体数量减少,尤以CA1最为明显。与生理盐水对照组相比,卡托普利组、氯沙坦组小鼠的大脑海马CA1细胞排列松散、结构破坏的现象均有所改善,且尼氏小体数目增加。而PD123319干预组与生理盐水对照组相比,上述现象无明显改变。4、免疫荧光染色结果显示,20周龄KK-Ay小鼠与20周龄C57BL/6相比,海马CA1区p-JNK与p-APP Thr 668表达较强;卡托普利、氯沙坦分别干预KK-Ay小鼠后,p-JNK与p-APP Thr 668表达减弱。而PD123319干预组与生理盐水对照组相比,上述观察指标无明显改变。5、20周龄KK-Ay小鼠与20周龄C57BL/6相比,海马组织ACE活性、AngⅡ、ACE、AT1R蛋白水平明显升高（P<0.05）,AT2R蛋白水平无明显改变,p-JNK水平明显升高（P<0.05）、总JNK蛋白水平无明显变化,p-APP Thr 668水平明显升高（P<0.05）、总APP蛋白水平无明显变化,Aβ40、Aβ42水平明显升高（P<0.05）。与生理盐水对照组相比,卡托普利组小鼠的海马组织ACE活性、AngⅡ、ACE蛋白水平下降,伴随p-JNK、p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平降低（P<0.05）;氯沙坦干预组小鼠的海马组织AT1R蛋白水平下降,伴随p-JNK、p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平降低（P<0.05）;PD123319组小鼠的海马组织AT2R蛋白水平下降（P<0.05）,而p-JNK、p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平无明显改变（P>0.05）。结论:2型糖尿病小鼠的学习、记忆功能下降可能与慢性高血糖引起的脑内ACE-AngⅡ-AT1R轴激活,p-JNK、p-APP Thr 668蛋白水平升高,Aβ40和Aβ42生成增多有关;分别予以卡托普利或氯沙坦干预T2DM认知功能障碍小鼠后,脑内ACE-AngⅡ-AT1R轴蛋白水平受到抑制,脑内p-JNK、p-APP Thr 668蛋白水平降低,以及Aβ40和Aβ42的生成减少,从而改善了T2DM认知功能障碍小鼠的学习、记忆功能。第三部分RAS在高糖诱导HT22细胞损伤中的机制研究背景:脑淀粉样蛋白假说是2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）认知功能障碍的几大发病假说之一。脑内肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）激活后可参与β淀粉样蛋白（amyloid beta,Aβ）代谢。Aβ由β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）经过β和γ分泌酶剪切生成。γ分泌酶剪切由β分泌酶剪切APP后形成的羧基末端片段时,需要c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）对APP苏氨酸668（Thr 668）位点进行活化。我们前期动物实验结果发现,T2DM认知障碍小鼠脑内ACE-AngⅡ-AT1R轴激活,伴随着脑内p-JNK、p-APP Thr 668水平升高,Aβ40和Aβ42生成增多;分别予以卡托普利、氯沙坦干预后,脑内p-JNK、p-APP Thr 668水平降低,Aβ40和Aβ42生成减少,小鼠学习记忆功能损伤有所缓解。但在细胞水平,RAS在高糖诱导小鼠海马神经元细胞（HT22细胞系）损伤中的分子机制尚未明确。目的:探讨RAS在高糖诱导HT22细胞损伤中的分子机制。方法:选用HT22细胞作为细胞模型,予以高糖干预作为高糖毒性模型,采用CCK8试剂盒,检测不同葡萄糖浓度和不同孵育时间对HT22细胞活力的影响。在高糖诱导HT22细胞稳定生长一定时间后,分别予以卡托普利（1μmol/L）、氯沙坦（1μmol/L）、PD123319（1μmol/L）、SP600125（5μmol/L）干预。实时荧光定量PCR检测细胞ACE、AT1R、AT2R的m RNA表达水平;Western blot检测细胞ACE、AT1R、AT2R、p-JNK、JNK、p-APP Thr 668、APP蛋白表达水平;ELISA检测细胞AngⅡ、Aβ40、Aβ42水平。结果:1、高糖干预HT22细胞呈浓度和时间依赖性影响细胞活力,本研究中选取75m M的葡萄糖干预HT22细胞48h作为高糖毒性模型。2、与对照组（25m M葡萄糖）相比,高糖（75m M葡萄糖）干预HT22细胞可使细胞ACE、AT1R的m RNA和蛋白表达水平升高,细胞上清中AngⅡ水平升高,细胞p-JNK、p-APP Thr 668蛋白水平升高,Aβ40和Aβ42水平升高（P<0.05）。3、与对照组（75m M葡萄糖）相比,卡托普利干预高糖处理的HT22细胞后,细胞上清中AngⅡ水平下降,细胞ACE m RNA和蛋白表达水平降低,伴随p-JNK、p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平降低（P<0.05）;氯沙坦干预高糖处理的HT22细胞后,细胞AT1R m RNA和蛋白表达水平降低,伴随p-JNK、p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平降低（P<0.05）;PD123319干预高糖处理的HT22细胞后,细胞AT2R m RNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）,而p-JNK、p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平无明显改变（P>0.05）。4、与对照组（75 m M葡萄糖+DMSO）相比,SP600125干预高糖处理的HT22细胞后,p-JNK蛋白水平降低,伴随p-APP Thr 668、Aβ40、Aβ42水平降低（P<0.05）,而ACE、AT1R、AT2R的m RNA和蛋白表达水平无明显改变（P>0.05）。结论:高糖毒性可引起神经元细胞ACE-AngⅡ-AT1R轴表达上调,p-JNK、p-APP Thr 668蛋白水平升高,Aβ40、Aβ42生成增多,从而导致认知功能损伤;分别予以卡托普利、氯沙坦干预高糖诱导的HT22细胞后,ACE-AngⅡ-AT1R轴受抑制后可通过下调p-JNK水平,降低p-APP Thr 668蛋白水平,减少Aβ40和Aβ42生成,从而发挥神经保护作用。