正链RNA病毒基因组为单股正链RNA,有感染性,可以直接作为mRNA起始病毒蛋白质的翻译,除逆转录病毒外,几乎所有的正链RNA病毒都编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。RdRp在RNA病毒的增殖复制期起到了非常重要的作用,它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因,另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA,所以它担负了复制酶和转录酶双重功能。正链RNA病毒的复制首先以基因组正链RNA为模板合成互补的负链RNA,然后再以合成的负链为模板起始子代病毒基因组正链RNA的合成,因此基因组正链和负链RNA模板的3’末端可能含有起始RNA复制所必须的顺式作用调控元件,如启动子、增强子等。正链RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA合成的分子机制主要有两种：引物依赖的RNA合成(Primer-dependent RNA synthesis)和引物非依赖的RNA合成即从头合成(De-novo RNA synthesis)。我室于2000年从茶尺蠖罹病幼虫中分离得到的一种新的非包涵体病毒,经分离纯化鉴定为微小RNA病毒,命名为茶尺蠖小RNA病毒(Evtropis oblique picorna-like virus, EoPV)。这是我国首次分离得到的昆虫小RNA病毒。EoPV基因组为正链RNA,5’UTR为390nt；3’UTR为43nt,有一poly(A)尾；含有一个大的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),编码一个聚蛋白前体,N端为结构蛋白,C端为非结构蛋白。根据最新报告,EoPV为传染性软化病病毒科(Iflaviridae),传染性软化病病毒属(Iflavirus)的成员之一。对EoPV基因组末端的氨基酸进行同源性比较分析,发现其具备典型的RNA依赖的RNA聚合酶结构域共有特征,含有最保守的基序GDD以及其它的保守基序,根据已有的晶体结构预测得到它的三级结构,与鼻病毒RdRp结构极其接近,呈右手型,具有3个亚结构域：掌型亚结构域(Palm subdomain)、拇指型亚结构域(Thumb subdomain)和手指型亚结构域(Finger subdomain)。为了探讨茶尺蠖小RNA病毒起始基因组RNA合成的分子机制,我们利用RT-PCR的方法扩增预测的RNA聚合酶编码区,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白,通过Ni亲和柱纯化到足量的可溶性蛋白。同时,建立稳定的体外RdRp复制系统,以病毒正链3’末端为模板,以人工合成的oligo(U)20为引物,通过Northern-blot法和RT-PCR对EoPV RNA聚合酶起始病毒RNA合成的分子机制进行研究。结果表明,EoPVRNA聚合酶具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,而保守基序GDD的突变导致功能完全丧失。实验也证实基因组末端的poly(A)尾对于RNA聚合酶功能的行使是必须的。对合适的反应条件进行摸索,发现EoPV RNA聚合酶的活性依赖于镁离子(Mg2+)和锰离子(Mn2+)的存在。反应体系中缺乏Mg2+或Mn2+均不能起始合成负链RNA。Mg2+对聚合酶的活性影响相对较小,在不同浓度下均可有效维持RdRp的活性,而Mn2+浓度的改变对RdRp的活性影响较大,最适浓度为1-2mM,在Mn2+浓度高于2mM时,活性显著降低。K+浓度在150mM时,活性最高,但当浓度继续加大,反而对酶活起抑制效果。实验表明EoPV RdRp反应的最适温度为30-35℃。本课题组卢杰等已在体内和体外证实了EoPV 5’UTR含有一功能性的IRES元件。我们将含有EoPV IRES的双顺反子表达载体,与构建的包含RNA聚合酶的载体共转染不同的细胞系(Sf9,S2,Cos-7),通过western检测表达的蛋白,并检测双荧光素酶表达量。结果表明,RNA聚合酶的表达抑制了IRES的活性,在Sf9中使IRES活性降低约50%,S2中降低20%,而在Cos-7细胞中抑制效果并不明显。实验表明该蛋白对IRES活性的下调作用随RNA聚合酶表达量的提高而增强,呈剂量依赖性特点。进一步将RNA聚合酶缺失N端和C端,发现N端的缺失导致蛋白对IRES的抑制效应丧失,而C端缺失对功能没有影响。显示N端是发挥功能的核心区域。综上所述,本研究揭示EoPV RNA聚合酶抑制了EoPV IRES依赖的翻译活性并呈现剂量依赖性,而对帽子依赖的蛋白翻译没有影响。我们的研究首次探讨了EoPV编码的非结构蛋白对IRES活性的负调控作用,对进一步研究IRES的功能和病毒的翻译机制提供了有力佐证。另外,根据已公布的EoPV核苷酸序列,巧妙利用基因组上单一的酶切位点,设计特异性引物,应用RT-PCR技术逆转录出5个覆盖全长的片段。随后采用融合PCR将5个片段拼接,最终将全长定向克隆到低拷贝质粒载体上,成功构建cDNA全长克隆p-EoPV。双酶切及测序鉴定证明全长克隆构建成功。与原序列比较发现,该克隆在氨基酸水平上有10个改变和3个缺失。为了筛选敏感细胞系,将全长克隆转染Sf9,Sf21,LD652等细胞,进行感染性克隆的积极尝试。