【摘 要】
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目的:胰岛β细胞功能受损是糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）的主要发病机制。葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin extracts,GSPE）能否螯合过量的铁,激活Xc-/GPX4通路拮抗胰岛β细胞铁死亡尚不清楚。本实验拟通过给予高糖高脂刺激细胞,同时给予GSPE和铁死亡抑制剂Fer-1干预,观察脂质过氧化及铁死亡相关指标的变化,探讨GSPE能否通
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目的:胰岛β细胞功能受损是糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）的主要发病机制。葡萄籽原花青素（Grape seed proanthocyanidin extracts,GSPE）能否螯合过量的铁,激活Xc-/GPX4通路拮抗胰岛β细胞铁死亡尚不清楚。本实验拟通过给予高糖高脂刺激细胞,同时给予GSPE和铁死亡抑制剂Fer-1干预,观察脂质过氧化及铁死亡相关指标的变化,探讨GSPE能否通过Xc-/GPX4通路拮抗高糖高脂诱导的细胞铁死亡,明确GSPE可能的干预靶点,为DM的防治提供实验依据。方法:选取小鼠胰岛β细胞（MIN6）建立高糖高脂（GP:25 mmol/L葡萄糖和200μmol/L棕榈酸钠）损伤模型,分别给予Fer-1和不同剂量的GSPE干预;使用Erastin抑制Xc-/GPX4通路后,施加不同剂量的GSPE干预。使用CCK-8分析细胞存活率;荧光显微镜观察ROS的荧光强度;试剂盒法测定SOD、GSH、MDA含量,Lillie染色检测细胞内Fe2+;试剂盒法检测线粒体膜电位的变化,Western Blot检测细胞中铁死亡关键蛋白GPX4和ACSL4以及通路蛋白SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM的蛋白变化情况。结果:1.铁死亡在高糖高脂诱导的MIN6细胞中的作用:MIN6细胞在给予高糖高脂24 h后,细胞活力显著降低,形态发生不规则改变,悬浮细胞数量增加,胰岛素分泌含量明显下降,给予铁死亡抑制剂Fer-1后,细胞存活率显著提高,贴壁细胞数量增加,部分细胞恢复正常形态,胰岛素分泌含量增加（P＜0.05）。同时Fer-1可以改善由高糖高脂造成的SOD和GSH的含量下降、MDA含量上升（P＜0.05）、细胞中ROS荧光强度的增加、以及Fe2+含量上升、线粒体膜电位降低。2.GSPE对高糖高脂诱导的MIN6细胞损伤中铁死亡的改善:单独施加10、20、30 mg/L的GSPE干预时,细胞的存活率无明显改变。在给予高糖高脂刺激的同时给予Fer-1和不同剂量GSPE,结果发现细胞形态和胰岛素分泌功能明显改善、细胞存活率提高（P＜0.05）;同时SOD和GSH含量上升、MDA含量下降（P＜0.05）、细胞中ROS荧光强度减弱、Fe2+含量降低、线粒体膜电位升高;铁死亡关键蛋白GPX4上调、ACSL4下调（P＜0.05）。3.GSPE通过Xc-/GPX4通路拮抗高糖高脂诱导的MIN6细胞铁死亡:在高糖高脂的基础上,施加Erastin干预24h后,细胞形态更不规则,尖端突出,附着松散,胰岛素分泌含量降低,Erastin进一步加重了细胞的损伤。加入Erastin后,细胞SOD和GSH的含量下降、MDA含量上升（P＜0.05）、细胞中ROS荧光强度明显增加、Fe2+含量上升、线粒体膜电位下降,加入不同浓度的GSPE共同培养24 h,结果发现GSPE仍然可以改善以上指标的变化。继续检测Xc-/GPX4信号通路蛋白发现,高糖高脂会抑制Xc-/GPX4通路蛋白的表达,分别加入GSPE和Fer-1干预后,通路关键蛋白SLC7A11、SLC3A2、GSS和GCLM的蛋白水平显著提高（P＜0.05）。当抑制Xc-/GPX4通路后,结果发现GSPE仍然可以提高通路关键蛋白表达水平（P＜0.05）。结论:GSPE作为一种铁螯合剂和抗氧化剂,可以通过抑制细胞发生铁死亡来减缓胰岛β细胞损伤。其机制可能是GSPE激活Xc-/GPX4信号通路抑制细胞铁死亡,从而缓解胰岛β细胞的损伤和功能障碍。本研究为DM的防治以及植物化学物在DM中发挥的作用提供了一定的参考依据。
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