【摘 要】
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目的:本研究使用C57BL/6NCrl小鼠进行光化学诱导卒中后脑缺血（photothrombosis ischemia,PTI）模型,探讨锌指蛋白结合框转化因子ZEB1通过调控转化生长因子TGF-β1信号通路对卒中后局灶性脑缺血后星形胶质细胞激活和脑胶质瘢痕形成的影响,从而进一步探讨ZEB1转化因子通过调控TGF-β1信号通路对脑胶质瘢痕的形成在小鼠局灶性脑缺血损伤中改善其远期认知感觉功能中的作用
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目的:本研究使用C57BL/6NCrl小鼠进行光化学诱导卒中后脑缺血（photothrombosis ischemia,PTI）模型,探讨锌指蛋白结合框转化因子ZEB1通过调控转化生长因子TGF-β1信号通路对卒中后局灶性脑缺血后星形胶质细胞激活和脑胶质瘢痕形成的影响,从而进一步探讨ZEB1转化因子通过调控TGF-β1信号通路对脑胶质瘢痕的形成在小鼠局灶性脑缺血损伤中改善其远期认知感觉功能中的作用。方法:将C57BL/6NCrl小鼠用脑立体定位仪定位后其在大脑皮层进行光化学诱导形成局灶性卒中后脑缺血模型（PT组）,在造模后的1 d、3 d、7 d、14 d、21 d后分别进行取材用于进行后续的实验。假手术组（Sham组）并不注射罗丹明B而是注射等量的生理盐水,后续步骤则相同。在进行光化学诱导法（photothrombotic ischemia,PTI）构建小鼠IS模型的前后24 h后分别用TTC染色通过梗死体积来观察小鼠模型的建立是否成功。使用Western blot和免疫荧光技术观察胶质瘢痕形成相关蛋白波形蛋白（Vimentin）,神经胶质原纤维酸性蛋白（星形胶质细胞活化的标志物）（GFAP）,锌指蛋白转化因子ZEB1,生长转化因子-β1（TGF-β1）观察各蛋白的表达量和在小鼠大脑皮层中星形胶质细胞中的表达水平。对于ZEB1-RNAi组以及NC-RNAi组,在进行PTI造模前21 d对小鼠照射的皮层部位注射相应的腺相关病毒,前者能够敲低ZEB1的表达,而对于Sham组和PT组则注射等量的生理盐水,其余步骤完全相同,以此用于观察ZEB1对卒中后远期脑保护的影响作用。接着进行PTI之后,使用Western blot以及免疫荧光检测GFAP、Vimentin、TGF-β1、ZEB1、Vglut1（突触前蛋白）、PSD95（突触后蛋白）的蛋白表达。利用透射电镜观察PSD95的形态及数量超微结构的变化。并通过水迷宫和粘连胶去除实验从而用于检测敲低皮层星形胶质细胞中ZEB1的表达对小鼠脑缺血14天后认知和感觉功能恢复的影响。结果:（1）与sham组相比,PT组（photothrombosis ischemia,PTI）TTC染色脑梗死体积更大,胶质瘢痕形成相关蛋白波形蛋白（Vimentin）,神经胶质原纤维酸性蛋白（星形胶质细胞活化的标志物）（GFAP）表达明显升高（P＜0.05）。而轴突相关形成蛋白Vglut1和PSD95的表达明显减少（P＜0.05）,透射电镜下轴突的形态和突触后相关蛋白PSD95的厚度均下降（P＜0.05）。Morris水迷宫以及黏粘胶祛除实验PT组小鼠感觉认知功能明显下降（P＜0.05）。（2）免疫荧光GFAP、ZEB1和TGF-β1标志物检测时,可观测到进行光化学诱导局灶性脑缺血模型之后,远期ZEB1和TGF-β1在星形胶质细胞中共表达且在第14 d两者表达量达到高峰,随后又逐渐降低（P＜0.05）。（3）当注射腺相关病毒特异性敲低星形胶质细胞中的ZEB1后,发现TGF-β1随着ZEB1的下降而降低（P＜0.05）。我们可以观测到特异性敲低ZEB1后（ZEB1-RNAi组）,与PT组相比,Vimentin和GFAP表达量会下降（P＜0.05）,而Vglut1和PSD95的表达量却增加（P＜0.05）,透射电镜下轴突的形态和突触后相关蛋白PSD95的厚度也会得到明显的改善和增加（P＜0.05）。NC-RNAi组与PT组比较以上蛋白的表达量没有明显差异（P＞0.05）。行为学实验ZEB1-RNAi组小鼠感觉认知功能都有一定程度的恢复（P＜0.05）。结论:（1）特异性敲低星形胶质细胞中的ZEB1的可通过靶向调控TGF-β1信号通路抑制星胶细胞的产生和减少胶质瘢痕的发生,从而改善远期恢复功能。（2）特异性地敲除皮层星形胶质细胞中的ZEB1对可以卒中后认知和感觉功能的恢复从而产生远期脑保护作用。
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