背景：颅脑创伤是一种高死亡率和高致残率的神经系统疾病,特别是年轻人致死致残的最主要原因。随着医疗救治水平的提高,颅脑创伤的死亡率有所下降,但致残率仍据高不下,发病率也一直在上升,而且主要发生在发展中国家,使得颅脑创伤成为全球性的公共卫生和社会经济难题。颅脑创伤病情的早期诊断和预后的准确评估意义重大,它决定了临床治疗方案的选择,并影响患者最终预后。但传统的评估方法(如格拉斯哥昏迷评分[Glasgow Coma Scale,GCS]和CT检查等)特异性和敏感性不高,且带有主观色彩,已不能满足现代医学的需求。近年来,磁共振弥散张量成像、磁共振波谱和功能磁共振等神经影像技术,脑电图、体感诱发电位和事件相关电位等神经电生理技术,以及生化标志物技术发展迅速,为颅脑创伤的病情诊断和预后评估提供了更为客观和准确的方法。在众多评估方法中筛选出准确性高、实用性强的指标,并建立一套颅脑创伤预后的综合评估体系是现代医学的研究重点和社会责任。炎性体是固有免疫领域近十年来的重大发现,它是一类细胞内的多蛋白复合体,一般由NOD样受体家族的部分成员(如NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白1[NLR family, pyrin domain containing1,NLRP1]、NLRP3等)和半胱天冬酶-1(caspase-1)以及辅助蛋白接头分子凋亡相关点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)组成。NOD样受体识别外源性病原微生物的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或者内源性损伤分子的损伤相关分子模式(Damage-associated molecular pattern, DAMP)后可组装成炎性体,并激活caspase-1,进而导致白细胞介素(interleukin, IL)-1β等促炎因子的成熟和分泌而引起固有免疫炎症反应,以及一种称为"pyrotosis"的细胞死亡的发生。中枢神经系统中,小胶质细胞、星形细胞和神经元均存在炎性体,能在感染或损伤的局部神经组织引起炎症反应,如胶质细胞的增殖、外周血白细胞的渗入,并造成继发性脑损伤。IL-1β是炎性体信号通路的主要产物,也是一种比较明确的神经炎症指标和脑损伤标志物,研究发现颅脑创伤患者外周血或脑脊液中IL-1β水平升高,且与临床病情和预后相关。炎性体是IL-1β的上游调节蛋白,在IL-1β的产生和神经炎症的启动中起重要作用,并与多种神经系统疾病的发病机制有关,也有研究发(?)NLRP1和NLRP3炎性体参与颅脑创伤病理生理过程,但其在颅脑创伤中的表达及作用仍不明确。因此,本研究的目的是：一、通过建立小鼠颅脑创伤模型以观察炎性体蛋白NLRP1和NLRP3在颅脑创伤中的表达情况；二、通过测定颅脑创伤患者脑脊液中NLRP1和NLRP3水平,以探讨炎性体蛋白对颅脑创伤临床病情和功能预后的评估作用。方法：1、炎性体蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠颅脑创伤模型中表达的实验研究：1.1、小鼠颅脑创伤模型的建立：实验动物选用C57BL/6小鼠(SPF级,雄性,10～12周龄,体重28～40g),小鼠随机分为正常对照组(n=5)、假手术组(n=5)和4个创伤组(n=8)。参考Shohami的小鼠自由落体打击模型自制重物打击装置,使333g重物从2.5cm高度自由落体打击鼠脑,以建立小鼠颅脑创伤模型。小鼠致伤后1h行神经损伤度评分(neurological severity score,NSS),取NSS7～8分者为重度脑损伤小鼠继续实验,分别于伤后6h、1d、3d和7d断头处死,取挫伤周围脑组织检测。1.2、Western blot法测定小鼠脑组织炎性体蛋白的表达：由小鼠挫伤周围脑组织提取总蛋白,考马斯亮蓝法检测蛋白浓度,根据蛋白浓度加样行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后予相应特异性抗体免疫目的蛋白,以β-Actin为内参考,用化学发光法和AlphaEase FC软件检测样品中炎性体蛋白的相对含量。1.3、统计学方法：应用SPSS13.0统计软件分析,组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD法。2、炎性体蛋白NLRP1和NLRP3对颅脑创伤患者预后评估作用的临床研究：2.1、颅脑创伤患者的纳入和管理：纳入2013年5月至7月于我科住院治疗的重型颅脑损伤患者20例,纳入标准为：伤后72h内入院、GCS评分≤8分和年龄>12岁。排除标准为：合并严重颅外脏器损伤、明显中枢神经系统感染、无法签署知情同意书和无法获取脑脊液标本。对照者为我科住院治疗的排除颅内感染的中型颅脑损伤患者(8<GCS<13)7例和非颅脑创伤患者8例。所有颅脑创伤患者入院后均行头部CT检查,CT结果按Marshall标准分6级。患者预后以伤后6个月的格拉斯哥预后评分(Glasgow Outcome Scale, GOS)评估,其中1～3分记为预后不良,4-5分记为预后良好。记录患者年龄、GCS评分、瞳孔反射、CT分级、GOS评分等临床资料。2.2、酶联免疫吸附法(ELISA)测定颅脑创伤患者脑脊液中炎性体蛋白的浓度：重型颅脑损伤患者脑脊液标本由侧脑室引流管或腰椎穿刺获取,于伤后24h和72h各取一次脑脊液,并以平均浓度计入统计,对照者脑脊液标本由腰椎穿刺获取一次。脑脊液炎性体蛋白浓度以ELISA法、购买试剂盒检测,操作过程严格按照产品说明书进行,予酶标仪读取标准物光度值并制作标准曲线,根据标准曲线将样品炎性体蛋白光度值换算为定量浓度。2.3、统计学方法：应用SPSS13.0统计软件分析,组间均数比较采用随机设计资料秩和检验(两组比较,Mann-Whitney检验；多组比较,Kruskal-Wallis检验；组间多重比较,LSD检测)。颅脑创伤患者NLRP3浓度与年龄、GCS评分和CT表现行Spearman等级相关分析,与GOS评分行线性回归分析。结果：1、炎性体蛋白NLRP1和NLRP3在小鼠颅脑创伤模型中表达的实验研究：1.1、小鼠颅脑创伤模型的建立：333g重物和2.5cm高度自由落体打击鼠脑后32只小鼠中大部分(24只)出现运动、平衡和反应等神经功能的明显障碍,平均NSS为(7.5±0.3)分,鼠脑大体标本亦可见皮层挫伤表现。另有3只小鼠NSS小于7分,5只小鼠于伤后1h内死亡,死亡率为15.6%,总体造模成功率为75%。1.2、小鼠脑组织炎性体蛋白的表达：Western blot结果显示小鼠脑组织中表达炎性体蛋白NLRP1和NLRP3,其中NLRP3水平在脑损伤后明显升高(P<0.05),且于伤后6h达到高峰然后逐渐下降,但至第7天时仍处明显的高水平。而创伤组各时间点的NLRP1水平与对照组比较并未见明显变化。2、炎性体蛋白NLRP1和NLRP3对颅脑创伤患者预后评估作用的临床研究：2.1、颅脑创伤患者脑脊液中炎性体蛋白的表达：重型颅脑损伤患者伤后脑脊液中NLRP3平均浓度为(33.8士11.6)ng/ml,明显高于中型颅脑损伤组([11.4±2.9]ng/ml,Z=-3.873,P<0.001)和正常对照组([1.1士0.3]ng/ml,Z=-4.068,P<0.001)。重型颅脑损伤患者伤后脑脊液中NLRP1平均浓度为(25.23±5.8)pg/ml,与对照组间差异无统计学意义。重型颅脑损伤患者中双侧瞳孔散大、侧瞳孔散大及正常瞳孔三组间NLRP3浓度差异有统计学意义(x2=7.484,P=0.024),组间多重比较LSD检验显示前两者与正常瞳孔组间差异均有统计学意义(P<0.05),而瞳孔散大组(一侧和双侧)间差异无统计学意义,说明瞳孔散大组NLRPP3浓度明显高于正常瞳孔组(P=0.024),其中瞳孔散大组脑脊液NLRP3平均浓度为(42.3士4.6)ng/ml,而瞳孔正常组脑脊液NLRP3平均浓度为(31.1士12.8)ng/ML。Spearman等级相关分析显示重型颅脑损伤患者NLRP3的脑脊液浓度与CT表现(r=0.601,P=0.005)明显相关,与年龄、GCS评分无明显相关。2.2、颅脑创伤患者脑脊液NLRP3浓度与临床预后的相关性：重型颅脑损伤预后不良组的NLRP3脑脊液浓度为(42.8±14.4)ng/ml,明显高于预后良好组([29.9±7.9]ng/ml,Z=-1.98,P=0.048),线性回归分析显示NLRP3浓度与患者伤后6个月的GOS评分明显相关(r=0.665,P=0.001)。结论：1、333g重物和2.5cm高度自由落体打击鼠脑可建立可靠的小鼠颅脑创伤模型,小鼠脑组织中存在炎性体蛋白NLRP1和NLRP3,而且脑损伤能上调NLRP3的表达,提示NLRP3炎性体参与脑损伤后炎症反应,尤其是神经炎症的早期阶段。2、颅脑创伤患者脑脊液中炎性体蛋白NLRP1浓度低,与对照组比较无明显变化,提示其作为脑损伤标志物的敏感性差。而NLRP3水平反映脑损伤程度,可作为评估颅脑创伤临床病情和功能预后的标志物。