【背景与目的】葡萄酒色斑(Port-wine Stain,PWS)又名鲜红斑痣,为先天性毛细血管畸形。在新生儿当中的发生率约为0.3-0.5%,其具有稳定庞大的发病人群。上世纪90年代我国首次将光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)应用于PWS的治疗,获得了显著的疗效。随着光敏剂的发展,结合第二代光敏剂:海姆泊芬(HMME)PDT成为治疗PWS的新的主流选择。治疗后病灶皮肤坏死作为其严重并发症之一,影响了HMME-PDT治疗的普及。同时,当因疗效不佳需探索新的光源及相应参数时,同样受制于治疗后皮肤坏死的限制。故探究HMME-PDT治疗后皮肤坏死的发生机制,探索怎样避免该严重并发症,具有十分重要的意义。针对HMME-PDT治疗后出现皮肤坏死机制的研究,国内外尚无文献报道。根据接受HMME-PDT治疗的患者长期密切随访,以及HMME-PDT治疗后出现皮肤坏死及瘢痕愈合的病程及临床表现,推测该并发症的发生可能由于治疗中过于激进的PDT参数调整或其他个人因素,导致真皮下血管网的过度破坏,出现皮肤坏死。本研究通过幼猪皮肤作为动物模型,探究在不同波长激发光源及不同能量下破坏的皮下血管显微构筑,了解皮肤坏死等并发症的病理基础及规律。将为阐明该严重并发症机制提供实验证据。【材料与方法】材料:本研究包括2月龄中国小型猪(白色)10只,其中5只雄性5只雌性(其中实验部位为幼猪腹部皮肤,备皮后使用)。上海复旦张江生物医药股份有限公司提供的光敏剂海姆泊芬HMME(复美达?)12支(100mg/支)。半导体激光器(波长:630nm)、倍频Nd:YAG激光器(波长:532nm)各1台。相关标本处理工具、动物麻醉药物若干、cd31免疫组化染色工具、tunel法检测细胞凋亡试剂盒及病理图片处理与统计软件(image-proplus6.0)。方法:构建幼猪皮肤动物模型,模拟正常人类皮肤。实验使用532nm、630nm激发光源及不同能量密度(80~160mw/cm2),使用光敏剂海姆泊芬(高剂量5mg/kg)。(1)记录治疗后不同时段皮肤反应。(2)接受不同激发光源及不同能量治疗的区域分别切取病理切片,通过免疫组化及特殊染色观察观察靶区域显微血管构筑破坏与皮肤坏死的关系。(3)在同一部位治疗后即时、2天、4天、7天,15、20天分别切取病理切片,通过免疫组化及特殊染色观察血管构筑破坏随时间改变情况。(4)联合630nm及532nm光源相互覆盖,观察皮肤安全性,并通过病理切片观察显微血管构筑破坏情况。【结果】10只实验动物中1只于实验观察阶段因肺部感染死亡。2只实验动物(a、b)中等能量密度100mw/cm2(40分钟照射)光动力治疗。630nm光斑处3天后出现轻微结痂,532nm光斑处无明显皮肤反应。20天观察终止,两者皆未出现皮肤损害。4只实验动物(c、d、e、f)接受较高能量密度120-130mw/cm2(630nm光斑照射40分钟,532nm光斑照射60分钟)光动力治疗。4只动物两组光斑3天后皆出现结痂。20天观察终止,其中3只630nm光斑处出现坏死后瘢痕形成(75%),532nm光斑处无一出现坏死及瘢痕(0%)。1只实验动物(g)接受高能量密度140-150mw/cm2(40分钟照射)光动力治疗。630nm与532nm光斑处3天后皆出现较厚痂皮。20天观察终止,皆出现皮肤损害溃疡未愈。1只实验动物(h)接受极高能量160mw/cm2(15分钟照射)光动力治疗。630nm与532nm光斑处3天后皆出现较厚痂皮。20天观察终止,两者溃疡愈合趋势,厚痂逐渐软化,无明显瘢痕形成。1只实验动物(i)接受较低能量密度80mw/cm2(40分钟照射)光动力治疗,部分光斑重合覆盖。630nm光斑处及重合覆盖处3天后出现结痂,532nm光斑处未重合区无明显皮肤反应。20天观察终止,两者皆未出现皮肤损害。相关免疫组化及TUNEL试验表明:630nm激发光源所破坏的血管构筑为深度1144.0um(1067.495um-1271.213um)的皮下血管网。532nm激发光源所破坏的血管构筑为深度921.9um(850.47um-999.753um)的皮下血管网。镜下观察表明:光动力治疗破坏血管构筑随时间无明显深度变化,治疗后3天可观察到表皮失营养破坏,15-20天出现表皮及真皮血管重构或瘢痕形成。【结论】532nm光源的安全性始终令人满意(尤其在120-130mW/cm2,60分钟的治疗中,表现良好)。630nm光源在较高能量密度下可能出现皮肤坏死等并发症。通过降低照射时间,可解决皮肤损害问题。921.9um-1144.0um深度的真皮下血管网的破坏与出现皮肤坏死等并发症密切相关。皮肤显微血管构筑(真皮下血管网)的破坏与治疗后随访时间无关。海姆泊芬光动力治疗葡萄酒色斑可能无治疗后续作用。较低能量下630nm与532nm光源联合覆盖照射安全性待查,而两者联合对于葡萄酒色斑的疗效值得期待。