由于创伤、先天性骨发育不良、肿瘤、骨质疏松症等原因引起的骨折后大段骨缺损(Bone defect,BD)的修复是目前骨科医生亟待解决的一个重大挑战。尤其是近几年,我国逐渐进入老龄化社会,由肿瘤、骨质疏松症等老年疾患引起的骨折、骨缺损也是逐年递增,对个人、家庭及社会带来巨大的痛苦及经济压力。骨移植修复重建是目前治疗骨缺损行之有效的方法,但骨移植修复材料要达到骨微结构层面的骨修复(Bone repair,BR)还相当困难。早期人们通常应用自体骨作为骨修复材料,虽然自体骨具有良好的生物相容性及骨微结构,能够较好发挥骨生成、骨诱导及骨传导等作用,但自体骨骨量有限,且供骨区的疼痛、感染等问题,会带给病人很大痛苦;同种异体骨、异种骨是相对比较好的自体骨替代品,但因其存在免疫排斥的问题,会阻止细胞的黏附与生长,最终会导致骨折不愈合,甚至感染等后果;金属具有较好的骨传导作用,但其抗腐蚀性及生物相容性较差,骨诱导、骨生成的能力不足,且弹性模量不匹配,通常会出现松动、脱落、断裂,甚至塌陷之可能。基于以上缺点,传统的骨修复材料逐渐淡出人们视线。目前,组织工程(Tissue engineering,TE)已经成为再生医学领域的一个可行选择,人工骨替代材料移植修复骨缺损成为医学重点。然而,骨缺损的修复和骨组织的再生仍然是一个很大的挑战,因为骨组织较硬,本身不易生长。传统人工骨支架主要是通过骨生成、骨诱导、骨传导三方面的作用原理来促进骨愈合。但是,骨组织修复重建过程中除了骨传导、骨诱导及骨再生外,持久功能化新生血管网络的建立也是大段骨移植成功关键,其为骨组织的生长、分化和功能化提供氧气和营养物质。骨缺损,尤其是大段骨缺损时,如果血管化不足,必将导致移植体中心部位缺氧、缺血,导致局部骨细胞死亡,最终骨移植失败。因此如何使骨移植材料内部快速形成血管网络化是目前亟待解决的问题。在组织工程方法中,缺损部位使用人工骨支架,为骨再生过程提供必要的生理和生物条件。这些支架材料必须具有能够促进和支持骨细胞、血管内皮细胞或其他相关生物因子浸润的作用,才能达到加速细胞黏附和增殖过程,促进成骨及血管化的目的,最终促进骨缺损修复。有研究证实,通过蛋白修饰后,改变材料表面形貌,可调控细胞行为,从而达到影响其所形成组织的微结构及生物功能。而与完整蛋白相比,多肽更能够对其引起的生物学效应进行精确控制,也更易作用于底物。特异性多肽可通过黏附蛋白或细胞外基质分子的特定肽段序列,促进内皮祖细胞在其表面黏附,降低内皮细胞(Endothelial cells,ECs)与其接触时的滚动速度,支持其动态黏附,触发血管再生。SVVYGLR多肽为骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)重要活性序列之一,具有特异性促进血管化作用,提高ECs黏附和迁移的活性,并诱导其分化,其促进血管再生的活性可与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)相媲美,甚至更强。同时SVVYGLR多肽具有双重生物活性,除了具有促进血管化作用,还有抑制破骨细胞生长、增强成骨细胞的增殖与分化,促进骨组织再生等作用。因此,通过多肽修饰优化支架材料是未来极具前景的组织工程技术,有可能为解决骨移植血管化难题提供新方法、新思路。为此,本课题组成员拟将具有双重促血管化作用及促骨形成的OPN源性SVVYGLR多肽通过共价修饰的方法结合在介孔硅酸钙(Mesoporous calcium silicate,MCS)粉体材料表面,从而活化该支架材料,利用3D打印技术构建SVVYGLR-MCS复合人工骨支架,并对构建的复合骨支架进行理化性能测试;检验其对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)、HUVECs的生物学影响,并阐明多肽修饰骨支架后促进血管生成的作用机制;动物体内实验测试其毒性、致敏情况,并验证其体内成骨、成血管作用。通过以上大量工作,发展一种可以解决骨移植材料内部血管化难题的高生物安全性新型骨修复材料,并为该种骨修复复合支架材料进一步应用于临床提供科学依据。本课题进行以下几方面的研究:1、制备MCS、SVVYGLR-MCS粉体及人工骨支架,并对其理化性能进行测试,为下一步实验提供材料基础。2、观察两组支架对骨髓间充质干细胞、HUVECs生物学影响,并研究SVVYGLR多肽修饰骨支架促血管形成机制,为下一步体内实验提供细胞学基础。3、观察SVVYGLR-MCS、MCS两组支架体内安全性及各自在兔桡骨骨缺损修复的能力,对比两组修复材料内部成骨、成血管的情况。结果提示:1、证明了MCS及SVVYGLR-MCS成功制备,具有高度有序的介孔通道,氨基化后依然高度有序,接枝SVVYGLR多肽后的粉体并未受到很大影响改变。MCS具有6 nm介孔孔道,MCS、SVVYGLR-MCS两组支架的孔隙率分别为(74.3±2.0)%、(65.6±2.0)%,抗压强度分别为(5.6±2.0)MPa、(5.3±1.0)MPa。浸泡模拟体液的pH变化显示:7 d后浸泡MCS、SVVYGLR-MCS两组支架的模拟体液pH分别为7.65±0.01、7.61±0.01;浸泡一个月后,MCS、SVVYGLR-MCS两组支架的残余量分别为(94.36±0.62)%、(93.16±0.16)%。2、SVVYGLR-MCS对大鼠BMSCs成骨诱导分化作用较MCS增强,ALP染色、ARS染色、PCR基因表达检测、Western blotting蛋白表达检测两组差异均有统计学意义(P<0.05);对HUVECs增殖两组差异无统计学意义(P>0.05),对HUVECs黏附、管腔形成两组差异均有统计学意义(P<0.05);SVVYGLR多肽促进血管再生的机制与OPN相同,就是直接通过PI3K/AKT作为正反馈信号调节ERK路径。3、X光片及大体观察,SVVYGLR-MCS组成骨作用优于MCS组;通过Micro-CT分析各骨长入参数,SVVYGLR-MCS组骨密度、骨小梁厚度、骨体积分数及骨小梁分离度情况均明显优于MCS组,两组差异均有统计学意义(P<0.05);HE切片染色及Masson染色显示SVVYGLR-MCS组骨母细胞浸润,甚至看见少量血管结构;以CD34、ZO-1免疫荧光染色标记12周骨缺损修复材料内部新生血管情况,也显示出SVVYGLR-MCS组促进血管形成作用更加明显。通过以上结果,得到如下结论:1、SVVYGLR-MCS人工骨支架力学性能良好,适合应用于骨缺损修复。2、SVVYGLR-MCS有利于大鼠BMSCs成骨诱导分化,有利于HUVECs黏附、管腔形成;SVVYGLR多肽促进血管再生的机制与OPN相同,就是直接通过PI3K/AKT作为正反馈信号调节ERK路径。3、SVVYGLR-MCS复合人工骨支架在体内修复骨缺损时,其内部成骨及成血管化作用明显优于MCS。