【摘 要】
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大肠杆菌基因组中的yigP位点不久前被鉴定为辅酶Q生物合成基因ubiJ,其表达受上游基因ubiE启动子的控制。然而,本实验室发现ubiJ编码区内还含有一个内部启动子(esrE启动子),介
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大肠杆菌基因组中的yigP位点不久前被鉴定为辅酶Q生物合成基因ubiJ,其表达受上游基因ubiE启动子的控制。然而,本实验室发现ubiJ编码区内还含有一个内部启动子(esrE启动子),介导基因转录生成一个252nt的转录物EsrE,后者以sRNA的形式参与大肠杆菌的生命活动,并可能与琥珀酸脱氢酶合成相关操纵子(sdhCDAB)的表达调控有关。有关证据显示,esrE启动子上游的P42区是负调控序列,但与该启动子及调控序列相互作用的蛋白因子尚未得以鉴定。本课题利用启动子探针质粒在esrE启动子上游区域鉴定出多个调控序列,它们可能分别或者协同作用于esrE启动子,并以激活或者抑制的方式调控其转录启动效应。顺式调控元件P42区的碱基突变实验进一步确认了该区域对启动子的影响,并发现对调控起关键作用的基序“GGCGAT”。该基序与其上游两个“ATCGCC”基序构成回文序列并协同作用,招募具有不同效应的蛋白因子共同参与针对esrE启动子的调控。本课题结合DNApull down和质谱技术分离并鉴定S1V3片段(即探针P-PRO,包含esrE启动子及其调控序列)的DNA结合蛋白,借助软件检索大肠杆菌K-12株数据库得到105组共207种潜在的候选蛋白。分别采用双质粒系统和凝胶阻滞技术对其中3个候选蛋白(RdgC、SeqA和RpoH)进行体内和体外实验确认,结果发现RdgC和SeqA蛋白的DNA结合结构域能非特异性地与esrE启动子区域结合,但并不影响esrE启动子的转录启动效率;RpoH蛋白对esrE启动子介导的转录呈激活效应。鉴于RpoH为已知的大肠杆菌RNA聚合酶构成亚基(即σ32),因此我们认为esrE启动子是由σ32因子识别并开启转录的。
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