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粗毛纤孔菌Inonotus hispidus(Bull.)P.Karst.为锈革孔菌科Hymenochaetaceae,纤孔菌属Inonotus的药用真菌,是我国传统名贵中药“桑黄”的正源。桑黄中含有多种药用有效成分,且具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂、降血糖、活血化瘀、保肝、抑菌和增强免疫力等药理活性。依据古代文献记载,桑黄的应用多以“酒煎”“酒热服”为主,且黄酒是自古以来中药药酒的主要酒基和中药炮制的常用辅料。因此,本文以桑黄和黄酒为原料确定最佳工艺,并进行安全性评价、有效性评价和质量标准,为中药桑黄的利用提供一个新产品。通过查阅文献对桑黄化学成分、药理活性、产品开发、保健酒、黄酒、古代和现代蘑菇保健酒研究进展进行了综述。实验部分包括桑黄酒最佳制备工艺的确定、安全性评价、有效性评价和质量标准的制定。桑黄酒的最佳制备工艺的确定:以桑黄和黄酒为原料,料液比(A)、浸提时间(B)和浸提温度(C)为考察因素测定其多糖和三萜含量设计正交试验;以酒精度(A)、甜味剂(B)和酸味剂(C)为单因素对调味工艺进行正交试验,制定桑黄酒感官评价并邀请志愿者进行评分。结果表明桑黄酒料液比3:60、浸提时间21 d、浸提温度25℃、酒精度14%vo L、冰糖3.0 g/100 m L和柠檬酸0.03g/100 m L时,呈棕黄色、色泽亮丽、酒体醇厚、口感及风味最佳。桑黄酒安全性评价:把40只雌雄各半的昆明小鼠分为空白组和桑黄酒组,连续灌胃14 d,记录小鼠体质量、摄食量和饮水量,并计算脏器指数。对心、肝、脾、肺、肾、睾丸、子宫和卵巢等脏器进行HE染色,同时测定IL-2、IL-6、TNF-α、BLA、BUN、SOD、MDA和Gsh-Px等相关因子表达量。结果表明桑黄酒给药组小鼠状态良好、摄食量和饮水量正常,未出现死亡现象,无法测出LD50,HE切片观察和相关因子表达量与空白组无显著或极显著差异,说明桑黄酒无急性毒性。桑黄酒有效性评价:(1)抗氧化活性评价:以维生素C为标准品,对比白酒、黄酒和桑黄酒的DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟基自由基清除能力和铁离子还原能力。结果表明,桑黄酒DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟基自由基清除能力和铁离子还原能力分别为82.1%、82.1%、75.9%和70%且均高于白酒和黄酒并接近维生素C。(2)抗肿瘤作用评价:通过建立H22荷瘤小鼠肿瘤模型将60只BALB/c雌性小鼠随机分为空白组、模型组、阳性组、桑黄酒低、中、高剂量组,阳性组腹腔注射环磷酰胺,其他组灌胃给药,连续14 d,并计算脾脏和胸腺指数及抑瘤率。对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化染色,ELISA试剂盒测定血清IL-6、IFN-γ、VEGF和TNF-α含量,同时利用Western blot方法检测肿瘤相关蛋白表达。结果表明随着桑黄酒剂量增加,抑瘤率逐渐升高,高剂量组抑瘤率可达38.4%;且桑黄酒给药组小鼠随着剂量递增脾脏指数逐渐下降,胸腺指数逐渐上升。HE切片表明,随着桑黄酒剂量升高,肿瘤细胞坏死、消融增多;免疫组化表明桑黄酒给药组小鼠肿瘤组织Bax、Casp ase-3和Caspase-9表达水平升高,Bcl-2表达水平降低。桑黄酒给药组小鼠血清中的IL-6、IFN-γ和TNF-α含量升高,VEGF含量降低。Western blot结果表明桑黄酒极显著增加Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达,降低Bcl-2表达,且与剂量成正比。表明桑黄酒可抑制小鼠肿瘤生长,提高小鼠的胸腺指数和免疫相关因子含量,其作用机制可能是通过线粒体途径上调促凋亡蛋白表达和下调抗凋亡蛋白表达以及死亡受体途径来抑制肿瘤增殖。(3)抗疲劳作用评价:将50只雌性KM小鼠随机分为空白组、阳性组和桑黄酒低、中、高剂量组,记录小鼠负重游泳力竭时间,随后测定血清中BUN和BLA,肝糖原,肌糖原等抗疲劳生化指标含量,以及血清和肝脏中的SOD、MDA和Gsh-Px等抗氧化生化指标,同时采用Western blot方法检测肝脏中的AMPK、p-AMPK、AKT、p-AKT、m T OR和p-m TOR等蛋白表达水平。结果表明,随着桑黄酒剂量增加,小鼠负重游泳时间增加;血清中BUN和BLA含量显著下降,肝糖原和肌糖原含量极显著升高;血清和肝脏极显著增加SOD和Gsh-Px含量,降低MDA含量。Western blo t结果显示桑黄酒给药组有效增加p-AMPK/AMPK、p-AKT/AKT和p-m TOR/m T OR比值蛋白表达水平。表明桑黄酒具有抗疲劳作用,其机制可能是通过AMPK介导自噬通路和降解氧化应激损伤的危害而保护线粒体和清除ROS的增加最终减轻小鼠疲劳程度。桑黄酒质量标准的制定:桑黄酒成分GC-MS检测、多酚、总黄酮、氨基酸含量和理化指标进行测定。通过GC-MS共分离出37个峰,鉴定为酯类、酸类、酮类、烷类、醇类和醛类等物质,其中醇类化合物最多,达到54%。采用紫外分光光度法,平行试验结果表明1 m L时多酚含量和总黄酮含量分别为1.439±0.12mg/m L和0.984±0.18 mg/m L。测出17种氨基酸总含量为4.5%,其中谷氨酸含量最高,而胱氨酸含量最低。理化指标测定总糖、总酸、非固形物、PH、酒精度、氧化钙、氨基酸态氮和苯甲酸等的含量,结果分别为11.02 g/L、7.82 g/L、3.30 g/L、14%vo L、3.70、0.098 g/L、0.329 g/L和0.023 g/kg。基于以上分析制定了桑黄酒的质量标准。本文首次研制了以黄酒为酒基的桑黄酒,对其进行了安全性和有效性评价,并制定了质量标准,为后续该桑黄酒的中试及扩大生产提供基础。