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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是一类广泛存在于水环境的机会致病菌,它不仅能引发多种水生动物的传染病,而且也是爬行类、两栖类、鸟类等动物的重要病原菌。抑制性差减杂交(SSH)一种以抑制性PCR为基础的寻找差异表达基因的方法,是细菌基因组比较,病原体中未知基因的筛选乃至分子进化分析的重要研究手段.
1.采用抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对嗜水气单胞菌强毒株J-1株与弱毒株MR-1株进行了基因组差异片段克隆与分析。共检出21个特异性差异片段,其中18个差异片段与气单胞菌及弧菌属基因有较高同源性,包括:黏附相关序列、调控序列、细胞分化序列、转录调节序列等,另外3个差异片段未发现有同源片段。结果表明,嗜水气单胞菌强毒株与弱毒株基因组间存在较多差异基因,为检测嗜水气单胞菌毒力株等奠定了良好的基础。
2.通过Ah强毒株J-1、弱毒株MR-1之间的抑制性差减杂交(SSH),选取其中4个可能与Ah毒力相关的片段,分别为与LPS生物合成及毒力作用有关的gne差向异构酶,调节毒力基因表达的BvgS因子,二硫化物结合蛋白异构酶DsbC,调理吞噬作用的FtsY基因。根据这4个片段的序列,设计了4对引物,用PCR方法对不同来源、不同毒力的22株嗜水气单胞菌进行了检测。结果表明,此4对引物中有3对可以有效地将致病株及无毒力株区分开来。此结果将有助于嗜水气单胞菌检测方法的建立。
3.用PCR扩增了Ah J-1株完整的gneJ基因,将其克隆至质粒pET32a(+),在大肠杆菌BL21中进行异源表达,SDS-PAGE结果显示重组表达蛋白的分子量约59.7kD,与理论推测值基本相同。酶活性分析表明该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺,确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Westernblot分析显示Ah J-1胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白,表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性,以重组蛋白为免疫原,对小鼠进行动物保护实验,显示该重组蛋白对小鼠有60%的保护率,证实了UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶与水生动物源性嗜水气单胞菌的毒力作用有关。