拟态弧菌、嗜水气单胞菌和致病性大肠杆菌是水产养殖中常见且重要的病原菌。近年来,由这些病原菌引起的鱼类细菌性疾病频繁发生,已成为制约我国鱼类养殖业健康发展的瓶颈之一。由于生产中长期大剂量使用抗生素,细菌产生耐药性,导致疗效甚微,亟需研发安全高效的抗生素替代品。鱼源β-防御素1（β-defensin1）是一种存在于多种鱼物体内、具有广谱抗菌和免疫调节作用的抗菌肽。与传统抗生素相比,鱼源β-defensin1因其抗菌作用机制独特且不易使细菌产生耐药性,而被认为是最有潜力的抗生素替代品。但是,该抗菌肽对特定病原菌的抗菌机制尚不清楚,严重阻碍了其在防治细菌性疾病中的应用。为此,本课题以草鱼β-defensin1为研究对象,借助细菌学、细胞与分子生物学等相关技术,研究其对上述三种病原菌的抗菌活性和作用机制,旨在为鱼类细菌性疾病的防治提供新方法。完成的主要研究内容与结果总结如下:1、Ciβ-defensin1蛋白的重组表达论文中根据Ciβ-defensin1（Ctenopharyngodon idellaβ-defensin1）基因和p ET-32a（+）载体序列设计一对带有酶切位点的特异性引物,以实验室保存的pc DNA3.1-Ciβ-defensin1为模板,PCR扩增Ciβ-defensin1基因,采用酶切酶连方法将Ciβ-defensin1基因克隆至原核表达载体p ET-32a（+）中构建重组原核表达质粒p ET-32a（+）-Ciβ-defensin1。该重组质粒经PCR及双酶切鉴定均获得一条大小约为153bp的目的基因DNA条带,测序结果也显示β-defensin1基因无任何突变或缺失,表明上述重组原核表达质粒构建成功。然后,将重组菌Rosetta-gami2（DE3）plys S/p ET-32a（+）-Ciβ-defensin1进行IPTG诱导表达与SDS-PAGE分析,可溶性表达产物用镍-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化,进而透析、浓缩和蛋白浓度测定,获得纯度约为95%、浓度为0.81 mg/m L的r Ciβ-defensin1蛋白。2、r Ciβ-defensin1蛋白对三种病原菌的抗菌活性检测论文中首先复苏实验室保存的拟态弧菌04-14菌株、嗜水气单胞菌BA1菌株和致病性大肠杆菌YE-1菌株,并对其进行形态、染色特性、培养特性和抗原性进行鉴定。然后,通过打孔法、微量稀释法和涂布计数法检测r Ciβ-defensin1蛋白对上述三种细菌的抗菌活性,并采用CCK8法检测该重组蛋白对CIK细胞是否有毒性。结果显示,r Ciβ-defensin1蛋白对三种病原菌的抑菌圈直径分别为24±0.15 mm（拟态弧菌）、22±0.20 mm（嗜水气单胞菌）和16±0.17 mm（致病性大肠杆菌）;MIC值分别为19.63μg/m L（拟态弧菌）、39.25μg/m L（嗜水气单胞菌）和78.5μg/m L（致病性大肠杆菌）;MBC值分别为157.04μg/m L（拟态弧菌）、341μg/m L（嗜水气单胞菌）和＞628μg/m L（致病性大肠杆菌）;经浓度小于或等于175μg/m L的r Ciβ-defensin1蛋白处理后的CIK细胞存活率达到96%以上。结果表明,抗菌肽Ciβ-defensin1对拟态弧菌、嗜水气单胞菌和致病性大肠杆菌均有体外抗菌活性,且对拟态弧菌的抗菌活性＞嗜水气单胞菌＞致病性大肠杆菌,而对CIK细胞毒性很小。3、Ciβ-defensin1对三种病原菌的抗菌作用机制初探论文中分别通过菌液OD630值测定法、ONPG试验、凝胶阻滞试验和BCA法检测r Ciβ-defensin1蛋白对三种病原菌的细胞壁完整性、细胞膜通透性、胞内DNA与蛋白质合成的影响,初步探讨其抗菌作用机制。结果显示,r Ciβ-defensin1蛋白对上述三种病原菌的细胞壁均有损伤、且能增加细胞膜通透性;能与拟态弧菌和致病性大肠杆菌的基因组DNA结合,但不与嗜水气单胞菌基因组DNA结合;均能抑制三种病原菌细胞内蛋白质合成。结果表明,抗菌肽Ciβ-defensin1是通过增强细菌壁膜通透性,干扰细菌DNA与蛋白质合成而发挥抗拟态弧菌和大肠杆菌作用,而对嗜水气单胞菌的抗菌作用主要涉及增加细胞壁/膜通透性和抑制胞内蛋白质的合成。综上所述,本课题在成功表达重组抗菌肽Ciβ-defensin1蛋白的基础上,明确其对上述三种病原菌均具有体外抗菌活性,且初步探讨了该抗菌肽抗三种病原菌的作用机制。研究结果可为鱼类细菌性疾病的防治提供新方法,也必将促进鱼源β-defensin1的开发应用。