论文部分内容阅读
桃（Prunus persica）是蔷薇科的重要经济果树。然而,桃树枝条年生长量大、树体管理难是限制桃产业快速发展的“卡脖子”问题,而冗余枝条的修剪又会造成果园人工成本增加、树体营养浪费和环境污染。另一方面,桃也是一种观花果树,研究桃花器官发育对提升其观赏价值也具有重要意义。研究表明,赤霉素（gibberellin,GA）是导致桃枝条生长快速的重要原因,同时也影响桃花芽分化和开花过程,但其在桃中的合成调控机制尚不清晰。INDETERMINATE DOMAIN（IDD）是植物特有的一类转录因子,可参与赤霉素的反馈调控及调控植物花形态建成。在本研究中,我们鉴定了桃IDD基因家族成员,并证明了桃中三个IDD成员（PpIDD4、-12和-13）可与PpDELLA1进行蛋白互作,并参与DELLA依赖型的GA合成反馈调控。同时,本文也鉴定到一个调控雌蕊柱头发育的IDD基因（IDD11）。主要研究结果如下:1.以PpDELLA1蛋白大量积累的矮生突变体‘粉花寿星桃（FHSXT）’为材料,证明了PpGA20ox1和PpGA3ox1是参与桃中GA合成反馈调控的关键成员。我们前期的工作表明‘FHSXT’中积累了大量的PpDELLA1蛋白和活性赤霉素,推测‘FHSXT’体内也存在保守的DELLA依赖型GA合成反馈调控机制且该机制被显著激活。为明确PpGA20ox1和PpGA3ox1是否是参与桃中GA合成反馈调控的关键成员,我们首先开发了一种弱光处理可显著提高叶片转化效率的方法,并通过该方法将PpGA20ox1pro-GUS转入‘粉花寿星桃（FHSXT）’自交后代桃苗叶片中,以非矮生‘秋蜜红’为对照。结果显示:PpGA20ox1启动子在‘粉花寿星桃’的叶片中可被显著激活。同时,本研究显示GA3处理下GA生物合成基因PpGA20ox1和PpGA3ox1的转录水平下调,而PBZ（GA合成抑制剂）处理下作用相反。上述结果表明,PpGA20ox1和PpGA3ox1是桃中GA合成反馈调控通路内的关键成员。2.桃中三个IDD成员（PpIDD4、-12和-13）与PpDELLA1蛋白存在互作。本研究在桃基因组中共鉴定出14个IDD家族成员。系统发育树显示14个IDD成员分属于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等7个不同亚组的6个亚组中。其中,桃中有3个PpIDDs（PpIDD4、-12和-13）成员与拟南芥中参与赤霉素合成反馈调控的At IDD2（GAF1）属于同一组,PpIDD11与调控花发育的ZmID1、OsID属于同一组。Y2H和Bi FC试验验证PpIDD4、-12和-13可与PpDELLA1发生蛋白互作。这表明桃中可能存在多个IDD-DELLA复合体参与调控GA合成。3.桃中三个IDD成员（PpIDD4、-12和-13）与PpDELLA1以复合体的形式激活PpGA20ox1和PpGA3ox1的表达。分析PpGA20ox1和PpGA3ox1启动子区域,分别鉴定出8个和9个IDD候选顺式作用元件。通过对PpGA20ox1和PpGA3ox1启动子区进行截段、分段和位点突变等试验,结果表明PpIDD4和-13主要与PpGA20ox1启动子的位点3和PpGA3ox1启动子的位点1结合,而PpIDD12与PpGA20ox1启动子的位点5和PpGA3ox1启动子的位点5结合。3个PpIDD蛋白均可识别的顺式作用元件其核心序列为TTGTC。同时,双荧光素酶试验表明,单独转化PpIDD或PpDELLA1不能激活PpGA20ox1pro-LUC和PpGA3ox1pro-LUC的表达,而PpDELLA1分别与PpIDD4、-12和-13共同转化时均可激活PpGA20ox1pro-LUC和PpGA3ox1pro-LUC的表达。4.PpIDD4、-12和-13可促进拟南芥生长。组织特异性分析结果表明PpDELLA1与PpIDD4、-12、-13均在芽和茎中高表达。构建PpIDD4、-12和-13过表达拟南芥转基因株系,发现PpIDD4、-12和-13过表达拟南芥后出现促进植株增高以及下胚轴伸长的表型。通过GA3/PBZ处理下胚轴试验发现,PpIDD12过表达拟南芥株系的下胚轴对GA响应最为显著。5.PpIDD11调控雌蕊柱头伸长。在‘秋蜜红’桃中克隆得到花发育相关基因PpIDD11,烟草亚细胞定位显示PpIDD11蛋白定位于细胞核,同时酵母转化试验表明其具有酵母转录自激活活性。荧光定量PCR分析显示PpIDD11主要在花器官中表达,特别在雌蕊中有最高的转录水平。PpIDD11过表达拟南芥株系出现了柱头高于野生型、荚果变短且植株结实率下降的表型,同时,也出现了莲座叶叶片卷曲、植株变矮的现象。转录组测序分析显示,PpIDD11过表达拟南芥株系共有上调基因3378个,下调基因3156个,其中包含LOX4、LOX3、GLC、E6L1等花器官发育调控基因。综上,本文从桃中鉴定出14个IDD基因家族成员,验证了PpIDD4、-12和-13通过与PpDELLA1形成复合体调控GA合成关键基因PpGA20ox1和PpGA3ox1,实现了桃中GA合成的反馈。同时,PpIDD11可促进拟南芥雌蕊伸长并影响花发育相关基因表达。本研究解析了IDD家族成员参与桃中GA合成以及雌蕊柱头伸长的调控机理,为进一步研究桃枝条抽长以及花器官发育提供一定的理论基础。