论文部分内容阅读
本文研究了葛根素(Puerarin)抑制缺氧牛肺动脉内皮细胞发生EnMT的作用以及Pur对通过抑制EnMT的发生治疗缺氧大鼠的分子机制,为治疗肺动脉高压提供新的手段。分离和培养牛肺动脉原代内皮细胞,通过细胞形态学和免疫荧光实验进行鉴定。鉴定为牛肺动脉内皮细胞后,培养至第2-5代时可以分组给药进行造模,牛肺动脉内皮细胞分别放在正常培养箱和缺氧培养箱中进行培养实验分组为:常氧组、缺氧组、缺氧+Pur。实验采用体外噻唑蓝比色法(MTT法)测定常氧及缺氧状态下不同浓度梯度的Pur对牛肺动脉内皮细胞增殖活力的影响,从而可能得到Pur最佳的给药浓度。划痕和Transwell实验检测缺氧对于牛肺动脉内皮细胞发生增殖和迁移的影响,和加入Pur后对于牛肺动脉内皮细胞发生增殖和迁移的影响进行比较。免疫荧光检测内皮标志蛋白和间充质标志蛋白的变化,Western blot法检测加入Pur后,Pur对牛肺动脉内皮细胞中EnMT相关蛋白表达的影响。饲养18只SD大鼠,实验分组为:Con组、Hyp组、Hyp+Pur,每组6只,饲养21天,SD大鼠按分组分别在正常培养箱与缺氧培养箱中进行饲养。实验采用小动物超声法、右心导管法和HE染色法证实是否造模成功。免疫荧光检测内皮标志蛋白和间充质标志蛋白变化,利用Western blot法和RT-PCR方法在蛋白水平和mRNA水平上检测加入Pur对牛肺动脉内皮细胞中EnMT相关蛋白表达的影响。根据MTT结果统计对于缺氧内皮细胞的作用Pur最佳给药浓度为250 μmol·L-1。划痕和Transwell实验证实加入Pur后可以由缺氧引起的细胞增殖和迁移。在蛋白水平,Western blot实验检测加入Pur后可以使血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)表达上调,波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白(Fibronection)、α-肌动蛋白(α-SMA)表达下调。在mRNA水平,RT-PCR检测结果与Western blot一致。在SD大鼠实验中,葛根素给药浓度为20mg/kg。小动物超声法检测SD大鼠主动脉内径的大小变化、右心导管法检测SD大鼠右心室收缩压变化和HE染色法检测肺组织中血管的厚度都证实SD大鼠缺氧造模成功,并且葛根素对缺氧性肺动脉高压大鼠可能有治疗作用。冰冻切片法将肺组织进行双染,凭借直观观察到常氧组中CD31红光强α-SMA绿光弱、缺氧组CD31红光弱α-SMA绿光强,常氧组CD31绿光强vimentin红光弱、缺氧组CD31绿光弱vimentin绿光强,说明缺氧可以使缺氧大鼠肺组织发生肺纤维化,从而可能导致成肺动脉高压,而在缺氧组中加入葛根素可以使CD31红光相对于缺氧组变亮,α-SMA绿光相对变暗,说明葛根素不仅对缺氧性肺动脉高压有治疗作用,对缺氧导致的肺纤维化也具有治疗作用。Western blot和RT-PCR测定无论蛋白水平还是mRNA水平缺氧加入Pur可以使CD31、VE-cadherin蛋白表达上调,Vimentin、Fibronection、α-SMA 蛋白表达下调。通过体内和体外实验检测EnMT相关指标的变化说明葛根素可以抑制EnMT的发生,从而对大肺动脉高压具有治疗作用。