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本研究通过头孢喹肟(Cefquinome,CEQ)对大肠杆菌体外静态浓度抗菌试验、体外动态模型模拟药动学过程抗菌试验以及对猪含药血清的半体内(Ex-vivo)试验,系统地考察了CEQ对大肠杆菌的抗菌作用特征;并将PK-PD同步模型与突变选择窗(mutant selection window,MSW)理论及Ex-vivo试验有机结合起来,开展耐药突变选择给药方案的筛选,从而制定合理的给药方案,以期更好的指导临床用药和减少耐药菌株的产生.研究的主要内容及结果分述如下:
1.MH肉汤中和猪血清中CEQ检测方法的建立
采用三氯乙酸/盐酸混合液沉淀血清蛋白,提取药物,反相高效液相紫外检测法测定血清中CEQ,检测限(Limit of detection,LOD)和定量限(Limit of quantification,LOQ)分别为6ng·mL-1和20ng·mL-1;采用乙腈沉淀MH肉汤中蛋白,LC-MS-MS检测MH肉汤中CEQ的药物浓度,以529.3～134.1作为定量离子对,其LOD和LOQ分别为1.5 ng·mL-1和5ng·mL-1.
2.测定了CEQ对大肠杆菌的防突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)、MSW范围及选择指数(selection index,SI)
采用琼脂二倍稀释法测定了CEQ对大肠杆菌标准株ATCC25922和50株临床分离株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和MPC,根据MIC和MPC的测定结果确定MSW范围和Si.CEQ对大肠杆菌ATCC25922的MIC和MIC99分别为0.125μg·mL-1和0.1μg·mL-1;采用肉汤法富集菌液后,测得暂定MPC和MPC分别为0.5ug·mL-1和0.256μg·mL-1;故MSW为0.1μg·mL-1～0.256μg·mL-1,SI(MPC/MIC99)为2.56.CEQ对50株大肠杆菌临床分离株的MIC90为0.2μg·mL-1;采用混菌法富集菌液后,测得MPC为0.8μg·mL-1;故MSW为0.2μg·mL-1～0.8μg·mL-1,SI(MPC/MIC90)为4.
结果表明:CEQ对大肠杆菌的抗菌作用符合MPC和MSW理论,且SI较小,MSW较窄,这表明CEQ有较强的防耐药突变株产生能力,产生耐药突变菌的可能性较小,不易筛选出耐药突变株.
3.考察了体外静态浓度下CEQ对大肠杆菌的抗菌活性
采用试管二倍稀释法测得:MH肉汤中CEQ对大肠杆菌ATCC25922的MIC和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)分别为0.032μg·mL-1和0.064μg·mL-1;血清中CEQ对大肠杆菌ATCC25922的MIC和MBC也为O.032μg·mL-1和0.064μg·mL-1;CEQ水解物对大肠杆菌无可见的抗菌活性. MH肉汤中CEQ对大肠杆菌ATCC25922杀菌动力学曲线及血清中CEQ对大肠杆菌ATCC25922的生长抑制曲线均表明:CEQ对大肠杆菌的抗菌作用效果与药物浓度高于MIC的维持时间(time that the drug concentration remains higher than the MIC,T>MIC)有关,因此CEQ为时间依赖性抗菌药物。MIC浓度和2MIC浓度的CEQ经过12h对大肠杆菌的抗菌作用后,分别使大肠杆菌对药物的敏感性下降1.5倍和3倍,容易导致细菌耐药菌株的富集、细菌对药物的敏感性降低和耐药性的产生.
4.体外动态模型中CEQ对大肠杆菌ATCC25922 PK-PD-MSW同步模型的研究
本研究模拟静脉注射给药一室开放模型的体外动态模型进行了改进.并利用此模型考察了不同给药方案CEQ对大肠杆菌ATCC25922的抗菌作用和影响其敏感性变化的因素.根据试验要求,模型中采用的初始菌液浊度为108 CFU·mL-1.
根据MIC、MPC、MSW的测定结果,体外动态模型设置分别为:①初始给药浓度(C0)小于MIC、处于MSW之内(即介于MIC与MPC之间)和大于MPC,具体浓度为1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC、MPC(=8MIC)和2MPC(=16MIC);②半衰期(t1/2)为6h和12h;③给药次数:单剂量给药和多剂量给药(24小时给药1次,连续给药3次).在预先设定的时间内进行细菌记数,测定细菌的MIC.
对PK参数和PD参数相关性分析表明:各给药方案的AUC0-∞与IE的相关性良好,其中各种趋势线中以多项式(阶数为3)拟合最好,但不同的给药方案拟合公式不同.结果表明:C0为1/2MIC浓度的模型中,几乎无任何抗菌作用;2MPC浓度的模型中呈现最强的杀菌作用.敏感性测定表明:C0处于MSW之内(为2MIC浓度和4MIC浓度)的给药方案,细菌的MIC有显著提高,即敏感性降低,容易导致耐药性的产生.C0为1/2MIC浓度和2MPC浓度的给药方案未见细菌上述敏感性的下降.
5.CEQ对大肠杆菌在猪体内和半体内(Ex-vivo)PK-PD同步模型的研究
测定了CEQ在猪体内的药动学特征和生物利用度.10头健康杂种猪,随机交叉设计试验,按1mg·kg-1b.w.的剂量分别交叉进行耳缘静脉和颈部肌肉单点注射给药,给药间隔时间为1周.采用反相高效液相色谱法测定血清中CEQ的药物浓度,用3P97分析程序处理血清中药物浓度-时间数据。
研究表明:单剂量耳缘静脉注射给药后,猪血清中CEQ的药时数据符合静脉注射二室模型，其主要药动学参数为:t1/2α为O.16h，t1/2β为1.34h，Vc为0.24L·kg-1，CL为0.26 L·kg-1·h-1，AUC为3.97μg·mL-1·h;颈部肌肉单点注射给药后，猪血清中CEQ的药时数据符合一级吸收二室模型，其主要药动学参数为:t1/2ka为0.08h，t1/2α为O.84h，t1/2β为2.76h，tmax为0.32h，Cmax为1.80μg·mL-1，CL为0.25L·kg-1·h-1，AUC为4.12μg·mL-1·h，F为104.54％. CEQ在健康猪体内的主要药动学特征为:猪肌注给药吸收迅速，达峰时间短;吸收完全，生物利用度高.静注、肌注给药均消除较快，消除半衰期短.
将试验结果的PK参数、PK-PD结合参数与Ex-vivo抗菌效应参数进行相关性分析及拟合，结果表明:AUC值与IE和△lg值拟合良好，分别用Boltzman方程和DoseResp方程处理，其中AUC值小于1.09μg·mL-1·h将无任何抗菌活性;AUC值为2.13μg·mL-1·h时产生抑菌效应;为2.63μg·mL-1·h时产生杀菌效应;完全清除细菌所需最低的AUC值为:3.93μg·mL-1·h.肌注和静注剂量分别为0.95mg·kg-1b.w.和0.99mg·kg-1b.w.时，可以有效的清除MIC值为0.032μg·mL-1的大肠杆菌，防止细菌产生耐药性.