【摘 要】
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中药细辛临床疗效显著,应用广泛,然而由于其“毒性”受到世界的普遍关注,其临床用药的安全性也受到了质疑,这极大程度上限制了细辛良好的药用价值的发挥。多糖具有低毒性且富有众多生物学功能的特点。本论文选取细辛多糖作为研究对象,采用多种色谱方法和技术,从细辛中分离纯化得到两个均一多糖,分别命名为ASP01-1和ASP01-2,并对分离纯化到的两个均一多糖进行了结构表征,同时对其免疫活性进行了研究。本论文主
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中药细辛临床疗效显著,应用广泛,然而由于其“毒性”受到世界的普遍关注,其临床用药的安全性也受到了质疑,这极大程度上限制了细辛良好的药用价值的发挥。多糖具有低毒性且富有众多生物学功能的特点。本论文选取细辛多糖作为研究对象,采用多种色谱方法和技术,从细辛中分离纯化得到两个均一多糖,分别命名为ASP01-1和ASP01-2,并对分离纯化到的两个均一多糖进行了结构表征,同时对其免疫活性进行了研究。本论文主要包括三部分内容:第一部分提取了细辛多糖并且进行了分离纯化,第二部分对细辛均一多糖进行了结构解析,第三部分为细辛均一多糖的免疫活性研究。首先将细辛药材经过水提醇沉和冷冻干燥得到细辛多糖,命名为ASP。细辛多糖经DEAE Sepharose Fast Flow凝胶柱分离,用水和不同浓度的氯化钠溶液作为流动相,使ASP分成具有不同电荷性质的4个部位多糖,命名为ASP-W、ASP01、ASP02、ASP03。部位多糖根据分子量大小选用Superdex TMG-75分子筛凝胶柱纯化,最终得到两个均一多糖ASP01-1和ASP01-2。第二部分对均一多糖的结构解析,通过一系列化学方法如糖组成分析、部分酸水解、糖醛酸还原、甲基化分析等和光谱学方法如NMR、IR、HPGPC、GC-MS等对两个均一多糖的一级结构进行了鉴定。ASP01-1的分子量为8×10~4Da,ASP01-2的分子量为3×10~4Da,单糖组成分析和糖醛酸含量测定表明ASP01-1由阿拉伯糖、木糖、半乳糖和半乳糖醛酸（2:1:3.5:0.5）组成,ASP01-2由阿拉伯糖、木糖、半乳糖和半乳糖醛酸（1:2:3.5:0.5）组成。对部分酸水解得到的主链和碎片进行了GC-MS分析,结合甲基化结果,证明了木糖不存在于主链,而是以木半乳糖醛酸聚糖结构存在,最终得出结论ASP01-1和ASP01-2是以1,4-α-Galp A为主链,阿拉伯糖、木糖、半乳糖在支链或末端相连的酸性杂多糖,是一种木聚半乳糖（XGA）型果胶。ASP01-2比ASP01-1含有更多的木糖,表明ASP01-2在HG骨架中有更多分支的木糖残基。第三部分内容主要对两个均一多糖ASP01-1和ASP01-2的免疫调节作用进行了探究。实验将不同浓度的均一多糖ASP01-1和ASP01-2处理RAW 264.7巨噬细胞24 h后测定其活力,发现ASP01-1和ASP01-2在12.5μg/m L、25.0μg/m L、50.0μg/m L、100.0μg/m L、200.0μg/m L的给药浓度区间对细胞活力无明显影响。并且检测了不同浓度的ASP01-1和ASP01-2对RAW264.7巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-6的影响,与空白对照组相比,给药组NO、TNF-α和IL-6分泌量显著增高,具有显著性差异,且在12.5μg/m L、25.0μg/m L、50.0μg/m L、100.0μg/m L、200.0μg/m L的浓度区间呈现出一定的浓度依赖性。通过CCK-8法检测了不同浓度的ASP01-1和ASP01-2对肝癌细胞活力的影响,结果表明ASP01-1和ASP01-2在12.5μg/m L、25.0μg/m L、50.0μg/m L、100.0μg/m L、200.0μg/m L的浓度区间对Hep G2肝癌细胞活力无明显影响。但经不同浓度的ASP01-1和ASP01-2均一多糖给药处理的RAW 264.7巨噬细胞培养上清液作用于Hep G2肝癌细胞,发现Hep G2肿瘤细胞生长活力受到抑制,且与空白对照组相比有显著性差异。结果表明ASP01-1和ASP01-2均一多糖可能是通过巨噬细胞的活化作用释放出的细胞因子如NO、TNF-α、IL-6来抑制肿瘤细胞的活力。
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