肌原纤维肌病(Myofibrillarmyopathies,MFMs)是一组临床表型复杂,具有丰富临床异质性与遗传异质性的疾病。该组肌病具有相似的病理表现,即:与肌原纤维相关的蛋白异常沉积,目前发现的致病基因有DES、CRYAB、MYOT、LDB3、FLNC、BAG3、FHL1、TTN、DNAJB6、PLEC、HSPB8A、ACTA1、MYH7等。其致病基因与先天性肌病、肢带型肌营养不良以及心肌病等存在重叠,提示其具有广泛的临床/遗传异质性,其致病机制多与肌原纤维相关蛋白、Z线相关蛋白等结构或功能异常相关导致肌纤维收缩异常而致病。该组肌病临床表现从远端型肌病、肢带型肌无力综合征、先天性肌病等特征性肌群受累,到肩腓综合征、足下垂、中轴肌受累、不对称性肢体无力等非对称性肌病等,临床表型包括多种形式的肌病特点。血肌酸激酶多轻度升高或正常。肌电图可出现肌源性、神经源性、肌源性合并神经源性等多种异常表现。MFMs的肌肉病理诊断主要依赖光学显微镜。典型的光镜病理表现包括:HE染色可见嗜酸性小体或嗜酸性物质;MGT染色示不定形或颗粒状的异染物质、镶边或非镶边空泡;在异常肌原纤维区域(特别是有嗜酸性小体区域),可见氧化酶活性局部减弱或缺失:擦涂纤维、漩涡纤维;可同时存在角化肌纤维及肌纤维群化等神经源性改变等。相似的病理表现其致病基因各异,以及复杂的临床表型都为肌原纤维肌病的诊断带来了不小的挑战,诊断必须基于致病基因分析;使用传统Sanger法基因分析在诊断阳性率、分型诊断、鉴别诊断、及时效方面均存在不同的局限性,目的基因捕获二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术,能够对多个基因的全部外显子一次性捕获、测序,达到99%碱基覆盖度,对每一个碱基检测平均测序深度达100重以上,快速、准确、一次性完成多个目的基因的外显子测序,其所用时间少、单碱基测序费用低及生物信息分析相对简单,因此更多应用于临床。弥补了Sanger测序在分子生物学诊断中的不足。本研究从河北医科大学第三医院活检骨骼肌遗传资源标本库(2005.3-2017.2,1598例)筛选:1)肌原纤维肌病(9例);2)无特殊病理改变的其他类型先天性肌病(9例);3)免疫组化染色阴性的肢带综合征12例进行临床、病理分析,目的基因捕获二代测序进行致病基因筛查,生物信息学分析得出的位点经患者及可获得的亲属Sanger法验证。第一部分肌原纤维肌病临床、病理及分子生物学研究目的:通过骨骼肌病理活检疑诊肌原纤维肌病的9例患者,通过目的基因捕获二代测序进行分子生物学研究,分析其可能的致病基因,以期总结临床表型、病理表现与致病基因有无相关性,探讨NGS在肌原纤维肌病中的诊断价值。方法:1.筛选入组患者临床、病理资料:1)临床表现:符合肌病的临床特点,缓慢进展加重的对称/不对称的四肢远端/近端肌无力、肌萎缩;2)肌酸激酶正常或轻度升高;肌电图肌源性和/或神经源性损害;3)活检骨骼肌组织化学染色可见肌细胞肌膜下胞浆中异常沉积物,在异常肌原纤维区域(特别是有嗜酸性小体区域),可见氧化酶活性局部减弱或缺失;2.收集患者临床资料,包括性别、起病年龄、就诊年龄、临床肌力评定、血清肌酸激酶结果、肌电图及神经电图结果、双下肢骨骼肌核磁结果、心肌核素显像结果等;3.活检骨骼肌组织化学染色病理分析,包括光镜与电镜;4.目的基因捕获二代测序,分子生物学分析可能的致病突变,Sanger测序验证。结果:1.临床资料:9例患者男性6例,女性3例,临床表现以远端肌无力起病4例,肢带肌无力起病5例;血清肌酸激酶升高6例,正常3例;肌电图检查单纯肌源性异常5例,合并肌源性合并神经源性异常3例,单纯神经源性异常1例。5例患者行心肌核素显像检查,其中正常3例,异常2例;7例行双下肢骨骼肌MRI检查者均有不同肌群脂肪沉积,均符合肌病影像表现。2.活检骨骼肌病理分析:9例患者均呈现肌病的病理表现,肌纤维直径大小不一,可见变性肌纤维,坏死与再生肌纤维少见。结缔组织轻度或轻中度增生,胞浆内肌膜下可见颗粒状、丝状、串珠状等异常物质沉积,NADH、SDH、COX酶染色可见肌原纤维网紊乱。3.目的基因捕获二代测序及分子生物学分析:9例患者中有4例未发现肌原纤维肌病相关基因致病突变;发现TTN错义突变(c.90211T>C,Cys30071Arg)1例,DES错义突变(c.1255C>T,Pro419Ser)1例,MYH7新发剪切突变(c.3337-2->C,splicing)1例;PLEC新发复合杂合突变(c.13001G>A,p.R4334H;c.10879G>A,p.D3627N)1例,MYH7已报致病突变(c.5533C>T,p.R1845W)1例。结论:1.肌原纤维肌病包括远端型肌病、肢带综合征、不对称肌群受累等临床表型,没有固定的起病形式与肌群受累模式,临床表现没有特异性。但不对称肌无力在临床表现中相对特异,早期即可合并心肌病、呼吸肌受累。2.骨骼肌活检具有特征性的病理表现,即胞浆内异常物质沉积,单克隆免疫组织化学染色相关蛋白深染对疾病诊断具有指向性。3.肌原纤维病致病基因与先天性肌病致病基因部分重叠。4.致病基因复杂,部分临床和肌肉病理符合MFMs表现的患者未发现其致病基因,故基因检测阴性的患者不能排除MFMs诊断。5.二代测序有助于该组肌病的分子生物学诊断,提高对胞浆内异常沉积性疾病的认识,扩大疾病谱系,丰富致病基因的临床内表型与临床外表型。第二部分非典型“先天性肌病”临床、病理及分子生物学研究目的:先天性肌病(Congenital myopathies,CMs)是一组单基因遗传骨骼肌疾病,具有临床及遗传异质性,活检骨骼肌病理存在特定的结构改变。但骨骼肌活检无特殊病理改变的先天性肌病患儿其诊断及鉴别诊断相对复杂,单纯病理改变无法为分子生物学诊断提供方向。本研究对临床、骨骼肌病理筛选出不典型先天性肌病患者9例,经二代测序致病基因分析进行分子生物学研究,筛查非典型先天性肌病致病基因,探讨肌原纤维病与先天性肌病重叠谱系疾病的临床表型、及遗传异质性研究,探讨二代测序在复杂的肌原纤维病与先天性肌病重叠谱系中的应用价值。方法:1.筛选入组患者临床、病理资料:1)临床表现:符合先天性肌病的临床特点,自幼起病,生后运动能力发育迟缓,伴有/不伴有智能发育异常,肌电图提示肌源性损害或神经源性损害或肌源性合并神经源性损害,血清肌酸激酶轻度升高或正常,骨骼肌活检病理无典型先天性肌病病理像,可除外杆状体肌病、中心核肌病、中央轴空病等特征性先天性肌病;2.收集患者临床资料,包括性别、起病年龄、就诊年龄、临床肌力评定、血清肌酸激酶结果、肌电图及神经电图结果、双下肢骨骼肌核磁结果、心肌核素显像结果等;3.活检骨骼肌组织化学染色病理分析,包括光镜与电镜;4.目的基因捕获二代测序,分子生物学分析可能的致病突变,Sanger测序验证。5.对部分基因检测提示COLA6基因异常患者行单克隆抗体抗COLA6免疫荧光染色。结果:1.临床资料9例患者中1例女性,8例男性,均为自幼运动能力发育迟缓患儿,严重者不能行走,轻者可跑跳活动;5例患者存在关节挛缩,8例患者四肢远端关节过伸展。2.实验室及辅助检查:血清肌酸激酶波动于86-1335U/L,6例患者表现为肌源性受累,1例为肌源性合并神经源性改变,以肌源性改变为主,2例以神经源性改变为主,5例行双下肢骨骼肌MRI检查者均有不同肌群脂肪沉积,无明显特异性肌群受累。3.骨骼肌活检病理分析:9例患者均为肌病表现,轻重不一,其中5例患者存在明显中心核现象,肌纤维6例患者结缔组织中重度增生,6例患者行抗胶原Ⅵ、胶原Ⅳ单克隆抗体荧光免疫组化染色,提示肌纤维膜及结缔组织内胶原Ⅵ蛋白缺失或减少。4.目的基因捕获分子生物学分析:在本组患者中,共发现5种基因异常,包括RYR1、LMNA、COL6A1、COL6A2、MYH7等,其中缺失突变2个,剪切突变1个,错义突变11个,其中新发基因突变10个;4例患者为已报致病突变。结论:1.儿童起病的遗传性骨骼肌疾病,临床表型相似:肌无力、肌萎缩、松软儿综合征、骨关节挛缩、畸形等,相同的临床表现其致病基因多样,骨骼肌活检对疾病的诊断具有一定的指向作用,但骨骼肌病理无特异改变时,需依赖分子生物学技术进一步确诊。2.先天性肌病与先天性肌营养不良临床表现相似,与肌原纤维病临床表型重叠。胶原Ⅵ蛋白相关肌病临床表型包括Ullrich型先天性肌营养不良,中间型VI型胶原蛋白病和Bethlem肌病,其中中间型可表现为先天性肌病,临床难以鉴别。3.骨骼肌活检未发现特征性病理改变的不能除外先天性肌病/先天性肌营养不良,以及肌原纤维病。4.二代测序技术对于非典型先天性肌病/肌营养不良、肌原纤维病重叠谱系的诊断提供了方法学依据。5.致病基因分析必要时需结合蛋白表达,以明确诊断。6.全基因组测序可能帮助临床医生认识新的疾病谱系。第三部分二代测序技术在肢带综合征的诊断价值目的:多种不同的肌病可导致肢带综合征即四肢近段肌、腰带肌无力、萎缩的表现,常见的有肢带型肌营养不良、先天性肌病、肌原纤维病等,其中肢带型肌营养不良具有丰富的遗传异质性,单纯病理改变无法为分子生物学诊断提供方向。本研究对临床、骨骼肌病理筛选出肢带型肌营养不良患者12例,经二代测序致病基因分析进行分子生物学研究,总结临床/病理特点。方法:1.筛选经临床、活检骨骼肌病理诊断肢带型肌营养不良患者12例。入选标准:1)临床表现:符合肢带型肌营养不良的临床特点,青中年起病的四肢近端肌无力、肌萎缩,缓慢进行性加重,肌电图提示肌源性损害,血清肌酸激酶值显著升高,骨骼肌活检病理提示肌营养不良病理改变,同时单克隆抗体免疫组织化学染色抗Dystrophin、抗Dysferlin、抗Sacoglycan等蛋白染色均正常。2.收集患者临床资料,包括性别、起病年龄、就诊年龄、临床肌力评定、血清肌酸激酶结果、肌电图及神经电图结果、双下肢骨骼肌核磁结果、心肌核素显像结果等;3.活检骨骼肌组织化学染色病理分析,包括光镜与电镜;4.目的基因捕获二代测序,分子生物学分析可能的致病突变,Sanger测序验证。结果:1.临床资料:12例患者中6例男性,6例女性,均以四肢近段肌、腰带肌无力为主要表现,4例伴有颈肌无力。2例为妊娠后症状明显加重。血清肌酸激酶均明显升高,肌电图检查均提示肌源性改变,5例行心肌核素显像4例提示心肌灌注异常表现;8例双下肢骨骼肌MRI提示不同程度脂肪浸润。2.活检骨骼肌组织化学染色:所有患者均呈不同程度肌营养不良病理改变,2例有大量典型分叶肌纤维。3.目的基因捕获分子生物学分析:12例病人中共发现7种不同的基因突变:发现4例患者携带CAPN3突变,1例患者TCAP纯合突变,1例POMT2复合杂合突变;1例FKRP复合杂合突变;1例PLEC复合杂合突变,1例GMPPB复合杂合突变,1例LAMA2复合杂合突变。结论:1.肢带综合征缺少特异性临床表现时要高度关注骨骼肌MRI,由此发现临床内表型特点。2.二代测序可以较好得解决肢带综合征的分子生物学诊断。3.本研究提高了对LGMD2的认识,特别是对少见类型LGMD2的表型认识,以及对LGMD2遗传异质性的认识。