背景:急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction,AMI）是全世界范围内引起死亡和致残的主要原因之一。在AMI患者中,早期、成功地进行溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention,PCI）以及外科冠状动脉搭桥术恢复缺血心肌血液再灌注是限制心肌梗死面积、改善心功能和临床预后的最有效治疗方法。然而,缺血的心肌组织在血运重建后,反而额外加剧了缺血心肌的损伤,引起细胞死亡,导致心肌梗死面积进一步增大,这一过程称为心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia Reperfusion Injury,MIRI）。心肌缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion;I/R）损伤的发生部分抵消了恢复血流的有益作用,并且成为导致心肌梗死血管再通后心脏不良事件的主要原因,严重损害患者的预后。目前缺血预处理是临床上唯一显示有利于减少再灌注后梗死面积的方法,但由于其仅适用于部分冠状动脉介入治疗应用非常有限。因此,深入探究再灌注损伤有关的分子和细胞机制,找到核心的调控靶点并对这一靶点进行干预,是治疗心肌缺血再灌注损伤的合理策略和目前需要急切解决的问题。心肌再灌注触发了从能量代谢异常到氧化应激等一系列复杂的细胞生物学过程,包括氧化应激、炎症、微血管阻塞和凋亡等。由于再灌注时能量和氧的瞬间恢复迅速改变细胞代谢活动。代谢紊乱可能是导致再灌注损伤的一个重要源头因素。前期代谢组学结果提示,组织再灌注开始时的代谢变化可引起广泛的与器官损伤和病理重塑相关的分子、生化和细胞事件改变。然而,在心肌缺血再灌注损伤进程中,关键代谢物的动态变化以及如何调控再灌注损伤尚不清晰。深入探索代谢紊乱如何影响心肌损伤对于探究再灌注损伤的潜在机制具有重要意义,对临床转化具有重要的指导意义。目的:从代谢的角度探索心肌缺血再灌注代谢物的改变情况,确定关键的调控因子并探索其调控缺血再灌注损伤潜在的分子机制。方法:第一部分:收集临床心梗病人血运重建前后血清,并建立小鼠心肌缺血再灌注模型,通过代谢组学检测各代谢组分在缺血及再灌注阶段的变化情况,发现ALOX12调控的花生四烯酸代谢物12-HETE对再灌注损伤响应最为敏感。通过Western blot和免疫荧光染色确定在再灌注前后ALOX12表达量的改变。通过分子生物学实验探索ALOX12在再灌注阶段升高的潜在分子机制。第二部分:利用野生型（WT）和Alox12敲除（Alox12-KO）小鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型,检测Alox12对心肌再灌注损伤的影响。其中,利用心脏多普勒超声检测评价小鼠心功能,通过检测心肌酶和肌钙蛋白等生化指标评价心肌细胞的损伤和坏死,利用CD11b和Ly6G免疫荧光染色评价心肌炎性反应,利用TUNEL染色和Western blot检测凋亡标志物的表达评价心肌细胞的凋亡。另外通过H＆E染色评价小鼠心肌形态学改变,PSR染色检测小鼠心肌纤维化的程度,TTC染色评价心肌坏死情况。同时通过RNA-seq数据分析小鼠心肌组织炎症、心肌细胞坏死、心功能等细胞事件的变化。第三部分:利用WT和Alox12-KO小鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型,探索Alox12调控心肌再灌注损伤的潜在分子机制。通过转录组学检测心肌缺血再灌注中关键信号通路的改变,确定下游靶分子。通过Western blot验证Alox12对下游靶分子的调控。利用WT、Alox12敲除、靶分子敲除和Alox12与靶分子双敲小鼠构建心脏缺血再灌注损伤模型。通过检测心肌酶与肌钙蛋白的变化评价各组心肌细胞的损伤。通过H＆E染色评价各组小鼠心肌组织的形态学改变。同时通过RNA-seq数据分析,比较Alox12敲除与双敲组炎症、凋亡、心功能相关基因变化情况。第四部分:利用原代心肌细胞建立缺氧/复氧（I/R）模型,利用RNA-seq数据分析检测Alox12催化代谢产物12-HETE对MIRI作用。通过Western blot检测12-HETE对AMPK磷酸化的影响。构建ALOX12-WT及其酶活突变（ALOX12（M））的腺病毒,通过Western blot检测二者对AMPK磷酸化的影响。利用Alox12-KO、12-HETE、ALOX12（M）及其对照组心肌细胞进行RNA-seq数据联合分析,比较ALOX12、12-HETE和ALOX12（M）对下游信号通路影响。第五部分:通过体外细胞实验探索ALOX12通过哪些具体的分子机制抑制AMPK的激活。通过Western blot检测AMPK上游磷酸酶/激酶的变化。通过免疫共沉淀与GST-沉淀检测ALOX12与AMPK上游磷酸酶/激酶的相互作用。通过蛋白互作质谱、泛素化实验与免疫共沉淀实验检测ALOX12是通过哪种方式来影响AMPK上游的激酶/磷酸酶。同时检测Alox12酶活位点突变之后是否影响其对AMPK信号通路的调控。结果:第一部分:代谢组学结果显示,再灌注阶段花生四烯酸（Arachidonic Acid,AA）代谢通路富集最显著,并且在上调的AA通路中ALOX12的特异性催化产物12-HETE上调最明显。同时Western blot结果显示在再灌注阶段ALOX12的表达量明显升高,与代谢组学结果相似,再灌注6h时ALOX12表达量最高。免疫荧光染色结果也显示再灌注时,与Sham相比ALOX12的表达量明显升高。对ALOX12升高的分子机制探索结果显示MIR中USP10的上调可能是心肌细胞ALOX12升高的潜在机制。第二部分:心脏超声结果显示Alox12敲除之后,与野生型对照相比再灌注之后心功能明显升高,同时反映心肌受损程度的心肌酶和肌钙蛋白含量明显下降。CD11b和Ly6G免疫荧光染色结果显示Alox12-KO小鼠心肌组织中炎症细胞浸润程度明显下降,且TUNEL染色与Western blot结果显示Alox12-KO小鼠心肌细胞凋亡明显减轻。H＆E染色结果显示与野生型小鼠相比Alox12-KO小鼠心肌坏死、肌丝断裂等心肌损伤程度明显减轻。PSR染色显示Alox12-KO小鼠心肌纤维化程度明显减轻。TTC染色结果提示Alox12-KO小鼠心肌坏死程度比WT小鼠明显要轻。RNA-seq结果显示Alox12-KO小鼠心肌细胞中炎症、心功能、细胞坏死信号通路明显下调。第三部分:RNA-seq结果显示Alox12敲除之后AMPK信号通路明显被激活。并且Western blot结果直接显示Alox12缺失显著增加AMPK活性。此外AMPKα2缺失之后心肌损伤程度明显加重;与Alox12-KO组相比,AMPKα2和Alox12双敲显著逆转Alox12-KO对心肌损伤的保护作用。对RNA-seq数据分析显示,Alox12-KO减轻的炎症、凋亡、心功能等依赖性基因表达的变化在很大程度上被AMPKα2-KO所逆转。第四部分:RNA-seq数据分析显示,12-HETE刺激促进了I/R导致的心肌细胞炎症反应和细胞死亡相关的基因表达,并且抑制了心肌细胞功能。12-HETE刺激原代心肌细胞结果显示,12-HETE不影响AMPK的激活。ALOX12酶活位点突变之后其催化生成的12-HETE含量显著下降。在原代心肌细胞中过表达ALOX12之后AMPK的磷酸化程度显著下调,与酶活位点是否突变无关。此外,RNA-seq分析显示,ALOX12（M）过表达显著促进了心肌细胞功能、细胞损伤和炎症反应相关的基因的表达,与ALOX12-WT具有相似的结果。利用Alox12-KO、12-HETE、ALOX12（M）及其对照组心肌细胞进行RNA-seq数据联合分析显示ALOX12对AMPK的调控是受其蛋白本身的调节而不是受到12-HETE的影响。第五部分:Western blot结果显示,ALOX12可以下调AMPK上游激酶TAK1的蛋白表达水平。免疫共沉淀与GST融合蛋白纯化显示ALOX12与TAK1有直接的相互作用。进一步的实验表明,ALOX12通过调控TAK1的泛素化降解途径促进TAK1的降解。蛋白互作质谱结合分子实验显示,ALOX12通过促进NEDD4对TAK1的泛素化降解,来最终促进TAK1的降解,并且这一功能与ALOX12的酶的催化活性无关。结论:在心脏再灌注过程中,AA代谢通路在再灌注阶段被显著激活,并且在AA代谢通路中ALOX12-12HETE轴在再灌注阶段上调最显著。升高的ALOX12可促进再灌注阶段心肌细胞的凋亡和坏死,心肌炎症和纤维化的发生。ALOX12主要是通过抑制AMPK的激活加重再灌注时心肌的损伤。并且,ALOX12抑制AMPK的激活不依赖于催化产生的12-HETE,而是通过促进NEDD4对TAK1的泛素化降解实现的,与其酶的催化功能无关。